免疫学基础学习pptflow cytometry ppt

1、流式细胞术原理及树突状细胞的检测苏州大学於葛华概念流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞仪（Flow Cytometer)使细胞（或其他粒子）以单个方式依次高速通过激发光束，采集细胞被光照时产生的各种信号，对信号进行处理，并对各参数进行关联分析的一种仪器。tttt功能特点（）单细胞（血液，细胞株，消化后实体瘤细胞（2） 多参数定量分析（3） 高通量、更敏感、更准确分析150，000个/秒 分选100，000个/秒（4） 细胞分选高纯度：99%以上；

2、可分析小于1/10000比例的稀有细胞群、单细胞克隆等Epics XL-ADC:最经典的分析型台式小机型:世界上第一台单激光四色机型，全矩阵荧光补偿，数字式流式细胞仪Epics Altra：最方便稳定的分析型分选型兼顾的大型流式分选机：最稳定、最灵活的高活性收获细胞的分选机Cytomics FC500最新的包含多种高新技术的多色分析机：第一台单激光5色机型，高灵敏度，全自动化设置检测对象悬浮在溶液中的0.2uM-300uM相互离散颗粒。对象举例细胞类型：（1） 高等真核细胞；（2） 酵母；（3） 细菌；（4） 多细胞的聚集体，如胰岛等。非生命颗粒：细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。临

3、床研究t 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞 因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测定端粒长度基础研究淋巴细胞功能、树突状细胞（DC）研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究（MDR）、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究基本原理t 光源t 488nm兰绿色，15mW空冷，氩离子激光或633nm氦氖激光t 标本台t 流动室(flow cell)l

4、鞘液SHEATH：(ISOTON II, III) PBSl 无颗粒，无荧光本底l 无菌，稳定的pHl 样本流SAMPLE 单细胞悬液51051106个/mlt 放大部分t 光电倍增管PMTHVt 放大电路 GAIN 增益l 线性：LINl 对数：LOGt 统计：计算机FLOWCELLInjector TipSheath fluidFluorescencesignalsFocused laserbeamFLOWCYTOMETRY(FCM)SAMPLELASERSIGNALLINLOGcomputerAMPPMT常用荧光染料的特性激发波长 (nm)发射波长(nm)t 荧光染料色t FITCt P

5、E(RD1)t ECDt PeCy5t PI用途颜488488488488488525575620675620免疫荧光免疫荧光免疫荧光免疫荧光DNA染色绿色橙色橙红深红橙红滤片t 带通滤片BANDPASS(BP)t 只允许某些波长的光通过630 nm BandPass FilterWhite Light SourceTransmitted Light620 -640 nm Lightt 二向色性滤片DICHROICFILTERt 一定波长以上通过，该波长以下折射Dichroic Filter/Mirror at 45 degLight SourceTransmitted LightReflec

6、ted lightOPTICS细胞分选系统Fluorescence Activated Cell Sorting488 nm laserFALS SensorFluorescence detectorCharged Plates-+Single cells sorted into test tubes信号t 荧光信号t FL1，FL2，FL3， FL4t 线性，对数t 散射光信号t 前向散射光(FS)： 细胞大小t 侧向散射光(SS)： 结构复杂程度直方图(HISTOGRAM)与点图(DOTPLOT)FL1FLDOT PLOTHISTOGRAMFL2COUNTGATE设门t 界定分析区域：RE

7、GIONt 十字门：QUAt 矩形门：RECA：AMOtAt 线性门：LINAt 建立直方图之间的关系方案PROTOCOLt 选定参数t 构建直方图t 区域，GATE，t 停止，存储，打印t 放大倍数，阈值，流速。t免疫荧光(IMMUNOPHENITYPING)单标记t 参数：FSLin,SSLin,FLLogAt 直方图：1FL1024SSt 同型对照(ISOTYPE)：同抗体类型、同荧光染料非抗人SAMPLE+ ISOTYPESAMPLE+ CD4COUNTFSA免疫荧光(IMMUNOPHENITYPING)双标记t 参数：FSLin,SSLin,FL1Log,FL2LOG直方图：tAAA

8、11102411024FL 1FL 2SSt 同型对照t 颜色补偿FL 2FL 1COUNTCOUNTFS1A光谱交叉荧光补偿PMT1放大1计算机PMT2放大2FL!FL!575nm525nmFL2FL2全矩阵颜色补偿最先进的方法是利用软件进行全矩阵颜色补偿（任何两个荧光检测通道之间都可以进行补偿）树突状细胞流式检测特点（1） 体积较大，表面多突起，容易吸附非特异荧光。（2） 未成熟DC有很强的吞噬功能，容易吞噬游离荧光分子，易检测到假阳性。（3） 吸附能力较强，容易堵塞流动池（FLOW CELL）。外周血树突状细胞的检测t 五色分析DC表达:CD(14+16)-FITC,CD85k(ILT3)- PE,CD45-ECD,CD33-PC5,CD2-PC7.t 同时检测和区分MDC和PDC人外周血中诱导扩增DC的表型分析t PBMC在加入GM-CSF及IL-4诱导的未成熟DC表型t 加入TNF-诱导的成熟DC表型DC的表型变化（）CD1a,CD40,CD80,CD83,CD86为人外周血中诱导扩增DC的主要表型检测指标。（）CD40,CD80,CD86在DC表面高表达。（）未成熟DC表面高表达CD1a。（）成熟DC表面高表达CD83。DC标记检测注意事项t （）因DC在低温环境下吞噬能力下降显著，标记前细胞应在4预冷，荧光抗体标记过程