微生物检验方法验证方案

1、微生物限度检查方法验证产品名称验证方案登记号XX公司微生物限度检查方法验证方案目录1. 验证目的2.验证小组及职责分工2.1验证小组2.2职责分工3.验证程序 4.验证结论及综合评价1. 验证目的确认所采用的细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法适合该药品的微生物限度检查。2.验证小组及职责分工2.1验证小组组长：小组成员： 2.2职责分工组长：负责验证期间各部门的协调及整个验证过程的具体实施。分析中心（微生物室）：负责验证方案的起草及具体实施，确保验证过程能按方案规定的程序进行，对各种验证资料（验证结果）应及时交与GMP组相关人员整理。GMP办：负责验证方案的编写规范；负责各种验证资料（

2、检查结果）的收集整理及结果的审核；审查验证报告及发放验证报告。质量管理部：参与验证方案的编制；负责验证方案的审核及批准；负责出具检验报告；并对微生物限度检查环境进行检测；负责验证文件的管理。3验证内容3.1品种：XXXX；批号：。3.2培养基：无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基，批号；霉菌液体培养基，批号； 营养肉汤培养基，批号；营养琼脂培养基，批号；0.1%蛋白胨溶液，批号；虎红钠琼脂培养基，批号；由中检所培养基室提供。（根据检验要求选择适宜的培养基）3.3方法：微生物限度检查方法验证（中国药典2005年版）。 3.5计数方法的验证3.5.1 验证试验用菌种：验证试验用的菌株传代次数不得超过5代

3、（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。a.大肠埃希菌(Escherichia coli)CMCC(B) 44 102b.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26 003c.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CMCC(B) 63 501d.白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F) 98 001e.黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F)98 003.5.2菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基

4、中，白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，培养1824h；黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基，培养57天。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含5001000cfu的菌悬液。3.5.3 供试液制备 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪（30005000r/min、24min）或其他适宜的方法，混匀，作为供试液。3.5.4供试液的稀释（10倍递增稀释法）3.5.4.1取34支灭菌试管，分别加入9mlpH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液。加稀释剂后，试管塞应立即塞上。3.5.4.2另取1支1ml灭菌吸管1：10均匀供试液1ml，加入装9mlpH7.0

5、的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液的试管中，混匀，即为1：100供试液，以次类推，可稀释至试验适宜的稀释级（针对各品种，此处应明确试验所要求的稀释级别）。每递增1稀释级时，必须加换一支吸管。3.5.4.3在作10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提出吸管，贴于试管内壁，调整液量至刻度，吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面），缓慢地放出全部供试液（吸管内应无粘附可残留液体）。3.5.5验证方法验证分为四组，至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。3.5.5.1试验组取最低稀释级的供

6、试液，按每1ml供试液加入50100cfu试验菌，按菌落计数方法测定其菌数。平皿法计数时，取试验菌液、供试液1ml分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平均测定法测定其菌数。3.5.5.2菌液组取上述试验菌液，测定所加入的试验菌菌数。3.5.5.3供试品对照组取最低稀释级的供试液1ml，接菌落计数方法测定其所含菌数。3.5.5.4稀释剂对照组为考察供试液制备过程对微生物的影响程度，用相应的稀释液替代供试液，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml含50100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。3.5.5.5试验组的菌回收率（%）=3.5.5.6稀释剂

7、对照组的菌回收率（%）=3.5.6结果判定稀释剂对照组的菌回收率均应不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，则可按该供试液的制备方法和菌落计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应建立新的方法，消除供试品的抑菌活性，并重新验证。3.5.7验证过程记录表1 菌液组的平均菌落数（cfu/ml） 实验次数金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉大肠埃希菌123表2 稀释剂对照组的平均菌落数（cfu/ml） 实验次数金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉大肠埃希菌123表3稀释剂对照组的菌回收率培养基稀释法（1ml加2个平皿）实验次数人工染菌回收

8、率%金葡菌枯草杆菌白色念珠菌黑曲霉大肠埃希菌123表4试验组的平均菌落数（cfu/ml） 实验次数金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉大肠埃希菌123表5供试品对照组的平均菌落数（cfu/ml） 实验次数金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉大肠埃希菌123表6试验组的菌回收率 实验次数人工染菌回收率%金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉大肠埃希菌1233.5.8结论检查人： 日期：3.5控制菌检查方法的验证3.5.1 验证试验用菌种：验证试验用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。a.大肠

9、埃希菌(Escherichia coli)CMCC(B) 44 102 b.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B) 26 003c.乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi-B）CMCC(B) 50 094d.铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B) 10 104e.生孢梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B)64 9413.5.2菌液制备：分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的营养琼脂斜面培养物少许，各接种至5ml营养肉汤培养基内，置361培养182

10、4h，取均匀培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养1824小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10100cfu的菌悬液。3.5.3 供试液制备 同“计数方法验证”供试液制备。3.5.4验证方法3.5.4.1试验组：取规定量供试液及10100cfu试验菌加入增菌培养中，依相应控制菌检查法进行检查。（当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中）3.5.4.2阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。3.5.5结果判定阴性对照组不检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法作该供试品的控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应参照“细菌