PCR引物设计及软件使用.ppt

1、,实时PCR引物、探针设计,及软件使用,厦门大学分子诊断教育部工程研究中心,引物的重要性,上游引物 聚合酶,DNA模板,dNTPs 下游引物,PCR反应的效率和特异性取决于两个方,面：,引物与模板的特异结合 多聚酶对引物的有效延伸,引物的设计对于PCR 反应极为重要!,特异靶序列 非特异靶序列,特异杂交 非特异杂交,分子信标 分子信标,探针的重要性 ,引物、探针设计,查找基因序列 序列分析 引物、探针设计 特异性验证,GenBank ClustalX Primer Premier 5.0 TM Utility v1.3 mfold BLAST,例:根据大肠杆菌rfbE基因序列，,设计引物和探针

2、,1.检索大肠杆菌rfbE的基因序列 National Center for Biotechnology Information 美国国立生物技术信息中心 ,GenBank DNA序列数据库拥有来自,47,000个物种的30亿个碱基,在“Search”搜索框 中选择“Nucleotide”,rfbE,检索结果中有很多无关菌，为查 找Ecoli.的rfbE基因带来麻烦,限制检索范围，将结果 锁定于待查目标,rfbE,Escherichia coli,基因序列长度,蛋白产物名称,相应氨基酸序列,rfbE基因序列,以纯文本文件格式保存,clusta

3、lx,2.基因序列分析，确定同源序列,同源序列区域,序列比对结果,3. 引物与探针的设计,（1）引物的设计,序列朗读,限制性内切酶位点分析,主要功能介绍 DNA与蛋白序列的互换 引物设计 语音提示键盘输入 DNA基元查找,引物设计的基本原则,引物与模板序列要紧密互补,引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错,配）,引物的长度,一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38bp,GC含量一般为40-60%,碱基的随机分布,引物中四种碱基最好随机分布，避免嘌呤、嘧啶堆积现象,避免引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC,

4、引物的3端,与目的位点必须完全同源,与非目的位点避免连续5-6bp的同源,引物设计的原则的原则,引物设计的原则,引物的Tm值,上下游引物的Tm值尽可能一致，Tm差异不应超过5C 根据Tm值，确定退火温度,G值：DNA双链形成所需要的自由能,3端G 值较低，5端和中间G 值相对较高,避免引物内部及引物之间二级结构的产生,引物自身：发夹结构、引物二聚体 引物之间：引物二聚体,引物的修饰,5端序列常用来引进修饰位点或标记物,导入同源序列,PCR模板及引物位置,上下游引物的性质,引物的二级结构,尽可能选取不形成二级结构的引物 选取二级结构能值较低的引物,（4.5kcal/mol）,3. 引物与探针的设

5、计,（2）探针的设计分子信标,TM Utility v1.3,mfold,环 臂 分子信标发夹结构,环：15-30nt,与靶序列互补的Tm比引 物Tm值高510 ，一般小于72 臂：5-7bp, 富含GC 荧光基团一般不直接标记在G上：5端 第一个碱基不为G 二级结构正确,分子信标设计的原则 序列保守,CCTCCG C ATCCAT,GGAGGC A GATTAA,上游引物,下游引物,探针区 ATCCATCAAATTAGCGGAGG CCTCCGATCCATCAAATTAGCGGAGG |,CCTCCGATCCATCAAATTAGCGGAGG,分子信标的二级结构,http:/blast.ncb

6、/Blast.cgi,4.验证引物与探针的特异性,AGGTGAAGGTGGAATGGTNNNNNNNNNN CTGTACATAGGCAATATTGGNNNNNNNNN NCTTGTTCTAACTGGGCTAA,5-AGGTGAAGGTGGAATGGT-3 5-CTTGTTCTAACTGGGCTAA-3 5- CTGTACATAGGCAATATTGG-3,更多信息,DnaSP 4.50.3 SNPHunter 1.75 G-InforBIO V1.89 Oligo 7.0 Beacon Designer 7.5 TGGE-STAR AutoDimer 1.0 MutaPrimer 1.0 PCR Analyzer 1.0 Primer 3 The Primer Generator AutoPrimer,基因多态性分析软件 SNP（单核苷酸多态性）查找软件 基因组数据建库与分析软件 引物分析著名软件 荧光定量PCR分子信标及TaqMan探针设计软件 PCR结合梯度凝胶电