文档第三章 核酸2016

1、第三章核酸核酸的概念和重要性核酸的组成成分DNA的结构DNA和基因组RNA的结构和功能核酸的性质核酸的序列测定一、核酸的概念和重要性1、核酸的发现2、核酸的种类3、核酸的分布4、核酸的生物学功能1、核酸的发现 1869 MIESCHER- 发现核酸 1944 AVERY et al- 肺炎球菌体外转化实验 1950 CHARGAFF et al- CHARGAFF 1953 WATSON，CRICK-DNA双螺旋 1973 BOYER，COHEN-DNA Cloning(克隆） 1990 Human Genome Project 1928年英国的细菌学家Griffith，肺炎双球菌转化实验：

2、1944 AVERY等肺炎双球菌体外转化试验DNARNA蛋白质荚膜注射人小白鼠体内无荚膜活菌有荚膜菌 说明RNA、蛋白质和荚膜多糖均不引起转化，而DNA却能引起转化。如果用DNA酶处理DNA后，则转化作用丧失。 首次直接证明DNA的遗能2、核酸的种类 脱氧核糖核酸（DNA，细胞核）Deoxyribonucleic Acid 核糖核酸（RNA，胞质）Ribonucleic Acid 脱氧核糖核酸（DNA） DNA为双链分子，其中大多数是线形结构大分子，也有少部分呈环状结构， 核糖核酸（RNA） RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链分子。3、核酸的分布真

3、核生物细胞核（98%） 线粒体（少量） 叶绿体（少量） 细胞质（90%）核仁（少量）原核生物拟核（类核部分） 质粒DNADNA RNA细胞质 生物细胞都含有DNA 和RNA；病毒中要么只含DNA，要么只含RNA。4、核酸的生物学功能 核酸是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。 核酸是现物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。二、核酸的组成成分一（）核酸的元素组成（二）核酸的基本组成单位核苷酸（一）核酸的元素组成 组成核酸的基本元素：C、H、O、N、P； 其中P 的含量比较稳定，占9%-10%，通过测定P的含量来推算核酸的含量（定磷法）。 DNA平均含磷量为9.

4、9%，RNA为9.4%。 任何核酸都含磷酸，所以核酸呈酸性。（二）核酸的基本组成单位-核苷酸核酸 nucleic acid或核糖核苷酸 nucleotide核苷 nucleoside磷酸 phosphate嘌呤碱 purine base或 嘧啶碱 pyrimidine base（碱基 base）核糖 ribose或 脱氧核糖 deoxyribose（戊糖 amyl sugar）1、嘌呤和嘧啶碱基2、特殊碱基3、戊糖4、核苷5、核苷酸1、嘌呤与嘧啶尿嘧啶胞嘧啶UracilCytosine腺嘌呤Adenine鸟嘌呤Guanine胸腺嘧啶ThymineDNA由A、G、C、T碱基构成。RNA由A、G、

5、C、U碱基构成。嘌呤碱：腺嘌呤鸟嘌呤1，3，7，9-四氮杂茚嘧啶碱：嘧啶（1，3-二氮杂苯）尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶RNADNA胞嘧啶 C碱基尿嘧啶 U胸腺嘧啶T腺嘌呤A 鸟嘌呤 G碱基互变异构含氧的碱基可以发生酮式-烯醇式之间的结构互变。2、特殊碱基植物中有大量5-甲基胞嘧啶。噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶代替CtRNA中修饰碱基较多。7-甲基鸟苷酸3、戊糖 组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为-D-2- 脱氧核糖；RNA所含的糖则为-D-核糖。HOCH2HOCH2OHOHOOHHHHHHHHOHOHOHHD-核糖D-2-脱氧核糖 核糖和脱氧核糖化学性质（P72）HOH2COHOHOH2COHO1

6、1OOHOHOH-D-2-核糖-D-2-脱氧核糖甲基间苯二酚核糖 + H+糠醛绿色产物RNA和DNA定性、定量测定-羟基-酮戊醛二苯胺脱氧核糖 + H+蓝紫色产物224、核苷（P51）核苷由戊糖和碱基缩合而成，糖环上C1与嘧啶碱的N1或与嘌呤碱的N9连接。糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键。OHOHNH2NH2NNNNNN9N9N1N1NH2NHOCH2NOHOONOHOHOCH2HOCH2HOCH2OHH1111HHHHHHHHHHHHHHOHOHOHOHOHOHOHOH胞嘧啶核苷腺嘌呤核苷鸟嘌呤核苷尿嘧啶核苷核苷的种类 DNA中的脱氧核苷： dA、dG、dC、dT； RNA中的核苷：

7、 A、G、C、U。P68假尿苷（）1，,5-糖苷键 C5 15、核苷酸 核苷酸结构 核苷酸种类 核苷酸的连接方式 核苷三磷酸 环化核苷酸 核苷酸其他衍生物B=腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺密啶1）核苷酸结构磷酸与核苷5位-OH脱水形成磷酸酯键OO55 BBHOPOH2CHOPOH2COOOHOH33OH OHOH核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸B为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶2）核苷酸种类 DNA 中含有脱氧腺苷酸 dAMP脱氧鸟苷酸 dGMP脱氧胞苷酸 dCMP脱氧胸苷酸 dTMP RNA 中含有腺苷酸 AMP，鸟苷酸 GMP，胞苷酸 CMP，尿苷酸 UMP，3)核苷酸的连接方式3

8、，5磷酸二酯键 多聚核苷酸链一端的C5 带有一个自由磷酸基，称为5-磷酸端 另一端C3带有自由的羟基，称为3-羟基端 4）核苷三磷酸腺苷三磷酸细胞中的核苷三磷酸都是高能磷酸化合物如：ATP、GTP腺嘌呤核苷三磷酸NH2NNOOONONO-PO-PO-POCH2O-O-O-HHHHOHOHAMPADPATP ATP的性质ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时, 可以释放出大量自由能。(P170)ATP也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多

9、生物化学反应的激活步骤。(P329)GTP(鸟嘌呤核苷三磷酸)GTP是生物体内游离存在的另一种重要的核苷酸衍生物。它具有ATP类似的结构,也是一种高能化合物。GTP主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体。在许多情况下, ATP 和 GTP 可以相互转换。(P332)5）环化核苷酸cAMP的结构明。 ATP在腺苷酸环化酶作用下脱下一分子焦磷酸形成cAMP。哺乳动物体内的激素很多是通过cAMP起作用 的，因此，cAMP被称为第二信使。 体内重要的环化核苷酸有3，5-环化腺苷酸（ cAMP） 和3，5-环化鸟苷酸（ cGMP）；它们不是核酸的组成成分，而是重要的调节物质。 cAMP 和 cGMP 的环状磷

10、酯键是一个高能键。在 pH7.4 条件下, cAMP 和 cGMP 的水解能约为43.9 kj/mol，比 ATP 水解能高得多。 微生物细胞内，还有cUMP、cCMP、cIMP，但功能不 6）核苷酸的其他衍生物及其功能 辅酶如NAD+、NADP+、FMN、FAD、CoASH的组成成分，参加细胞内的氧化还原反应和酰基转移反应；（P158） ppGpp、ppApp在细菌代谢中起调控作用 GTP参与蛋白质合成，CTP参与磷脂合成，UTP参与糖的合成； 医疗中，ATP作为能源药物用于心力衰竭急救，cAMP用于心肌梗死，阿拉伯糖苷有抗DNA病毒作用，用于抗癌。三、DNA的结构 一级：核酸中核苷酸的排列

11、顺序。 二级：DNA的两条多聚核苷酸链间通过氢键形成的双螺旋结构。 三级：DNA双链进一步折叠卷曲形成的构象。(一)DNA的一级结构核酸中核苷酸的排列顺序。由于构成核苷酸单元的戊糖和磷酸基是相同的，体现核苷酸差别的实际上只是它所带的碱基，所以脱氧核苷酸的序列常被认为是碱基序列（basesequence)。DNA一级结构的表示方法 竖线式竖线表示戊糖，竖线上方为碱基，中间连接P为磷酸基 文字式5 pApTpCpGpApTpCpG-OH 35 pATCGATCG-OH 3常用ATCGATCG 5在左侧，3在右侧，P在核苷之左表示与C5相连，在右表示与C3相连，有时P也可省略，仅以字母表示核苷酸的序

12、列(二) DNA的二级结构1953年，Watson和Crick提出了DNA的双螺旋结构模型。1、Watson-Crick双螺旋结构建立的根据1）Chargaff 规律（P55）A=T，G=C2）X射线衍射数据DNA沿长轴有0.34nm和3.4nm的周期性变化，Franklin分析得出DNA具有螺旋结构。3）电位滴定证明嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接。2、 Watson-Crick双螺旋结构模型(P56)2.0nma. 两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴相缠绕，形成右手双股螺旋。b. 嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在外侧。c. 螺旋平均直径2nm，每圈螺旋含10个核苷酸，螺距3.

13、4nm，碱基平面间距离0.34nm。d. 两条核苷酸链，依靠彼此碱基间形成的氢链结合在一起。A=T、G=C。碱基平面垂直于螺旋轴。小沟大沟碱基互补原则具有极重要的生物学意义：DNA的复制、转录、反转录等的分子基础都是碱基互补。碱基间的连接(碱基互补)碱基配对及氢键形成3、 稳定双螺旋结构的因素(P72)碱基堆积力。包括范德华作用力和疏水作用力。碱基对间的氢键。GC含量越多，越稳定。环境中的正离子。磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定。DNA双螺旋的构象类型B-DNA：92%相对湿度，DNA钠盐，那样接近细胞内的DNA构

14、象。A-DNA：75%相对湿度，与溶液中DNA-RNA杂交分子的构象相似，推测转录时发生BA。Z-DNA：人工合成的DN段d（CG），主链呈锯齿型左向盘绕，直径约1.8nm，螺距4.5nm，螺旋表面只有小沟。DNA结构的多型性A型粗短B型中Z型细长外型螺旋方式右手右手左手直径（nm）每转碱基对数目碱基对间垂直距离（nm）螺距（nm）存在条件2.3112.0101.8120.250.340.372.8体外脱水3.4生理条件4.5CG序列锯齿型骨架走向平滑平滑DNA三链、四链结构(P60) 在多聚嘧啶和多聚嘌呤组成的DNA螺旋区段，序列中有较长的镜像重复序列时，可形成局部三股螺旋。 DNA的三链结

15、构常出现在DNA复制、重组、转录的起始或调节位点，第三股链的存在可能使一些调控蛋白或DNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。 端粒DNA中存在四链DNA结构，为串联重复的鸟苷酸链，生物学意义有待深入研究。DNA结构的不均一性1、 反向重复序列（回文序列）（P59）DNA序列中，以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同。2、 富含A T的序列高等生物中，A+T与C+G的含量差不多相等，但在它们的染色体的某一区域，A T含量可能很高。在很多有重要调节功能（不是蛋白质编码区）的DNA区段都富含A T碱基对。特别是在复制起点和启动的Pribnow框的DNA区中，富

16、含A T对。这对于复制和转录的起始十分重要，因为G C对有三个氢键，而A T对只有两个氢键，此处双键易解开。回文结构（序列）(inverted repeat, palindrome sequence)u较长的回文结构，在某些因素作用下可形成十字形结构或发夹结构。转录的终止或转录活性的调控作用与回文结构有关。(P306)u较短的回文序列，可作为一种特别信号，如限制性核酸内切酶的识别位点。(P296)(三) DNA的三级结构-超螺旋 超螺旋是指双螺旋进一步扭曲形成的构象 双链环状DNA 双链线状DNA环状DNA生物体内有些DNA是以双链环状DNA的形式存在，包括：某些病毒DNA、噬菌体DNA、细菌

17、DNA、细菌质粒DNA真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA环形DNA的不同构象（1）松弛环形DNA线形DNA直接环化（2）解链环形DNA线形DNA拧松后再环化（3）正超螺旋与负超螺旋DNA线形DNA拧紧或拧松后再环化，成为超螺旋结构。以B型DNA为例：如果在一端使绳子向缠紧的方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋，以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。即旋转方向与双螺旋缠绕方向相同。如果在绳子一端向松缠方向旋转，再将绳子两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋，以解除外加的旋转所造成的胁变，这样的超螺旋称负超螺旋。即旋转方向与双螺旋缠绕方向相反。天然DNA平均每10

18、0bp上有3-9个负超螺旋。负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起，很易解链，易于参加DNA的复制、重组和转录等需要将两条链分开才能进行的反应。三种环状DNA分子具有相同的结构，但是拓扑构象不同，称它们为拓扑异构体。拓扑异构酶(Topoisomerase)：DNA拓扑异构体之间的转变是通过拓扑异构酶来实现的。J. Wang和M. Gellert首先发现了这类酶。拓扑异构酶有两种类型：topo和topo。topo可以切断一个链，使双螺旋DNA转变为松弛环状。topo则相反，通过切断二个链，在消耗ATP情况下，可以在松弛的DNA中引入负的超螺旋。在不消耗ATP情况下， 可消除负超螺旋。（P62）

19、线状DNA 双链DNA多数为线形分子真核细胞染色质和一些病毒DNA分子 DNA的存在形式-核小体H1H2A、H2B H3H4组蛋白的组成组蛋白八聚体H1组蛋白核小体染色体的结构真核生物染色体包装DNA核小体螺线管突环 微带 染色体人中期染色体中含6.2*109bp(碱基对)，其理论长度应为200cm，这么长的DNA被包装在46个5um长的圆柱体(染色体)中，其压缩比约为104。分裂间期染色质比较松散，压缩比大约是104。四、DNA与基因组RNATranscriptionDNATranslationProtein（mRNA、tRNA、rRNA）基因是DN能单位。段的核苷酸序列，DNA分子中最小的

20、功结构基因基因基因组调节基因病毒、细菌基因组的特点（P64）1.2.3.基因组较小。DNA大部分为结构基因，每个基因出现频率低。功能相关基因串联在一起，并转录在同一mRNA中（多顺反子），指导多种蛋白质的合成，这种结构称操纵子。4.有基因重叠现象。(病毒)ABCDEFG真核生物基因组的特点(P65)1.基因组较大。2.不含操纵子结构。3.重复序列单一序列：在整个DNA中只出现一次或几次。低度重复序列：只有数个拷贝。假基因。中度重复序列 ：在DNA中可重复几十次到十万次。高度重复序列 ：可重复几百万次高度重复序列一般富含A-T或G-C，富含A-T的在密度梯度离心时在离心管中形成的区带比主体DNA

21、更靠近管口；富含G-C的更靠近富含A-T主体DNADNA（satellite DNA）管底，称为富含G-C4.有断裂基因 ：由于基因中内含子的存在。transcription内含子（intron)：基因中不为多肽编码，不在mRNA中出现。外显子（exons）：为多肽编码的基因片段。例外：组蛋白基因(histongene)和干扰素基因(interferon gene)没有内含子。mRNA1 872bp7 700bpABCDEFG五、RNA的结构与功能 RNA通常以单链形式存在，但也可形成局部的双螺旋结构。 除A,U,G,C四种碱基组成外，还含有较多的稀有碱基. 不严格遵循碱基配对原则（P326）

22、 主要的RNA种类有mRNA、tRNA、rRNA、hnRNA、snRNA、snoRNA、asRNA和RNAi等。（一）mRNA 的结构与功能 mRNA约占总RNA的3%-5%，含量最少，种类最多。是蛋 白质合成的模板。真核生物mRNA的前体在核内合成， 包括整个基因的内含子和外显子的转录产物，形成分子大小极不均匀的hnRNA。 从功能上讲，一个基因就是一个顺反子，原核生物的mRNA是多顺反子，真核mRNA是单顺反子。顺反子：是由顺反试验所规定的遗种蛋白质的基因。位，相当于一1、 真核mRNA (单顺反子)一般为单顺反子结构，即一个mRNA中只含有一条多肽链信息，能指导一个蛋白质的生物合成；大多

23、数真核成熟的mRNA分子具有典型的5端的7-甲基鸟苷三磷酸（m7GTP）帽子结构和3端的多聚腺苷酸(polyA)尾巴结构。 真核生物mRNA 5-端帽子结构（p315帽子的功能：可抵抗5核酸外切酶降解mRNA。可为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。 真核生物mRNA 3-端的polyA结构PolyA是转录后，经polyA聚合酶添加上，约30-300核苷酸的polyA；polyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA，其polyA较长；而衰老的mRNA，其polyA较短。polyA功能：PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。PolyA大大提高

24、mRNA在胞质中的稳定性。2、 原核mRNA（多顺反子） 5端无帽状结构，3端不含polyA结构 一般为多顺反子结构，即一个mRNA中常含有几个蛋白质信息，能知道几个蛋白质的生物合成， mRNA代谢很快，代谢半衰期一般以秒计，很少达到10min以上。原核mRNA由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5/帽子和3/polyA。举列：MS2病毒mRNA，3569 b，有三个顺反子，分别编码A蛋白、外壳蛋白和复制酶三种蛋白质。5端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5-AGGAGGU-3，子AUG前约10核苷酸处，此序列由Shine和Dalgarno发现，称位于起始SD序列。（p32

25、6）SD序列和核糖体16S的rRNA的3末端富含嘧啶碱基的序列互补，这种互补 序列与mRNA对核糖体的识别有关。mRNA的功能 mRNA分子中带有遗传为蛋白质的合成提供模板。，其功能是 mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组，在蛋白质翻译合成时代表一个特 （二）tRNA的结构与功能tRNA约占全部RNA的15%，分子较小。在蛋白质生物合成过程中转运氨基酸，且每种tRNA可运载一种特定的aa，一种aa可由一种或多种tRNA运载。碱基组成中有较多稀有碱基。3末端为CpCpA-OH，用来接受活化的氨基酸，此末端称接受末端。5末端大多为pG或pC二级结构是三叶草形tRNA二级结构（三叶草结构） 氨基

26、酸臂：由7对碱基组成, 末端为-CCA，接受活化氨基酸 二氢尿嘧啶环：也称“D 环”，含2个二氢尿嘧啶 反子环：7个核苷酸组成，中部为由3个碱基组成的反子 可变环：3-18个核苷酸组成, 大小不等，可用于鉴别tRNA TC环：含假尿苷，胸腺嘧啶核苷tRNA的三级结构（倒L结构） （三）rRNA的结构与功能 rRNA占总RNA的80%左右。 rRNA是构成核糖体的骨架，与核糖体结合蛋白一起构成核糖体，为蛋白质的合成提供场所。23S、5S rRNA及34种pro.构成16S rRNA及21种pro.构成50S原核生物70S核30S糖体28S、 5.8S、5S rRNA及49种pro.构成60S真核

27、生物80S18S rRNA及33种pro.构成40S （四）snRNA、snoRNA（P69） snRNA主要存于细胞核中，占细胞RNA总量的0.11%。 与蛋白质以RNP（核糖核酸蛋白）的形式存在，在hnRNA和rRNA的加工、细胞分裂和分化、协助细胞内物质运输、构成染色质等方面有重要作用。snoRNA参与rRNA前体的加工，指导部分snRNA及tRNA的甲基化修饰。 （五）asRNA、RNAiasRNA可通过互补序列与特定的mRNA结合，抑制mRNA的翻译，还可抑制DNA的复制和转录。dsRNA稳定性增加，抑制特定基因的表达。RNAi技术。 （六）非编码RNA的多样性不编码蛋白质，以RNA

28、形式发挥作用的RNA称非编码RNA（noncoding1R.按N功A能,n分cR类N：A）。催化RNA(核酶)、类似mRNA的RNA、指导RNA、tmRNA、端粒酶RNA、信号识别颗粒、微小RNA、小干扰RNA2.根据细胞内的分布分类：核小RNA、核仁小RNA、胞质小RNA、Cajal小体3.根据大小分类：21-25nt的ncRNA、100-200nt的ncRNA、大于10000nt的ncRNA六核酸的性质一般理化性质核酸的紫外吸收性质核酸结构的稳定性核酸的变性核酸的复性核酸的分子杂交6.1一般理化性质1.为电解质，通常表现为酸性。2. DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，不溶于有 机溶

29、剂。3. DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。4. RNA能在室温条件下被稀碱水解而DNA对碱稳定。5. 利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。D核糖浓盐酸苔黑酚D2脱氧核糖酸二苯胺绿色蓝紫色 核酸酶1）按作用底物分类：核糖核酸酶：牛胰核糖核酸酶、核糖核酸酶T1/T2脱氧核糖核酸酶：牛胰脱氧核糖核酸酶、牛脾脱氧核糖核酸酶2）按水解部位分:外切核酸酶：蛇毒磷酸二酯酶(35外切酶)牛脾磷酸二酯酶(53外切酶)内切核酸酶: Hind、EcoR （P296）6.2核酸的紫外吸收性质（p72）核酸的碱基具有共扼双键，因而有紫外吸收性质，吸收峰在260nm（蛋白质的紫外吸收峰在280nm）。核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少3040%，当核酸变性或降解时光吸收值显著增加（增色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。0.40.30.2核苷酸总吸收值变性DNA天然DNA0.10220240260280300波长 /nm光吸收 核酸的紫