第02章蛋白质的结构与功能

1、蛋白质的结构与功能,第2章,Structure and Function of Protein,什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)构成的具有特定空间结构的高分子有机物。,蛋白质在生命活动中的重要作用,生物催化作用 免疫保护作用 运动与支持作用 运输和储存作用 代谢调节作用 控制生长和分化 接收和传递信息,生物膜 高等动物记忆和识别,氧化供能,抗冻蛋白（antifreeze protein ）,荧光抗冻蛋白装饰的冰晶体,抗冻蛋白，附着在冰晶体表面，抑制冰晶体生长，防止有机体冻伤。,蛋白质的分子组成The Molecular Component of

2、Protein,第一节,组成蛋白质的元素,主要有C、H、O、N和 S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量 (g %) = 每克样品含氮克数 6.25100,1/16%,蛋白质元素组成的特点,举例： 一个生物样品的含氮量为5%，它的蛋白质含量为： （ ） A. 8.8% B. 12.5% C. 16.0% D.38.0% E. 31.25%,三聚氰胺事件,一、氨基酸,存在自然界

3、中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸 （甘氨酸除外）。,C,+,N,H,3,C,O,O,-,H,(一)氨基酸的结构特点,氨基酸的共同特点：,（1）两性电解质 （2）除甘氨酸外都是L 型氨基酸 （3）侧链R基团结构和性质不同,非极性疏水性氨基酸 极性中性氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸,(二)氨基酸的分类,1.依侧链R基团的结构和理化性质分:,非极性疏水性氨基酸,极性中性氨基酸,带正电荷的碱性氨基酸,带负电荷的酸性氨基酸,几种特殊氨基酸,脯氨酸 （亚氨基酸）, 半胱氨酸,胱氨酸,二硫键,2.营养学分类,必需氨基酸：赖、色、苯丙、甲硫、苏、亮、 异亮、缬 非

4、必需氨基酸：12种,3. 根据氨基酸结构分类,（1）脂肪族氨基酸：甘、丙、丝、苏、半胱、甲硫、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬、谷、精、赖。 （2）支链氨基酸：缬、亮、异亮。 （3）芳香族氨基酸：苯丙、酪、色。 （4）杂环氨基酸：组、色。 （5）杂环亚氨基酸：脯,(三) 氨基酸的理化性质,1. 两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子

5、,阴离子,H+,2. 紫外吸收性质,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,3. 氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物,氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。 由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。,二、肽,肽键是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,（一）肽 (peptide)与肽键(peptide bond),+,甘氨酰甘氨酸,肽键,肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合

6、物。,两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,N 末端：多肽链中有游离-氨基端 C 末端：多肽链中有游离-羧基端,多肽链有两端：,丙氨酰酪氨酰天冬氨酰甘氨酸,（二）生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),氧化型谷胱甘肽（GSSG）,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2.多肽类激素及神经肽,蛋白质的分子结构The Molecu

7、lar Structure of Protein,第二节,蛋白质的分子结构包括:,一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure),定义: 蛋白质的一级结构指在蛋白质中氨基酸的数目、排列顺序及共价连接。 氨基酸排列顺序从N-端至C-端的。,一、蛋白质的一级结构,主要的化学键: 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,二、蛋白质的空间结构,蛋白质构象又分为主链构象和侧链构象，主链构象指多肽链上各原子的排

8、布及相互关系；侧链构象是指各氨基酸侧链基团中原子的排布及彼此关系。 主链构象决定侧链基团的排布，侧链构象影响主链构象的卷曲和折叠，二者相互依存，相互影响。,（一）蛋白质的二级结构 (secondary structure),主要的化学键：氢键,肽单元,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。,-螺旋 ( -helix) -折叠 (-pleated sheet) -转角 (-turn) 无规卷曲 (random coil),蛋白质二级结构,蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合

9、形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。,1. -螺旋(-helix),Linus Pauling Robert Corey,-螺旋的结构特点:,为一右手螺旋，螺旋每圈包含3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm，每个氨基酸残基向上平移0.15nm，直径0.23nm。 相邻2圈螺旋间第1个肽单位的C=O与第4个肽单位的N-H形成氢键，氢键方向与螺旋纵轴平行。 肽链中氨基酸残基的R基团均伸向螺旋的外侧，其空间形状、大小及电荷对-螺旋的形成和稳定有重要的影响。,2.-折叠（sheet),Tu,-折叠的结构特点,(1) 多肽链充分伸展，由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成片状结构。相邻肽平面呈

10、110夹角，主链骨架伸展呈锯齿状。 (2) 相邻主链之间靠氢键维系。氢键的方向与肽链长轴垂直。肽链中氨基酸的残基的R侧链分布在片层上下。 (3) 两端肽链可以是平行的，也可以是反平行的。反平行式更为稳定。,-转角,第一个氨基酸残基的C=O与第四个残基的NH形成氢键,3. -转角（-turn),无规卷曲（random coil）,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,蛋白质分子中各种二级结构,（二）超二级结构(supersecondary structure),超二级结构又称模体（motif），是指在多肽链内顺序上相互邻近的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成规则的二级

11、结构聚集体。,模体常见的形式,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,（三）蛋白质三级结构(tertiary structure),整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,定义:,磷酸甘油酸激酶的结构域,结构域(domain)： 是蛋白质构象中特定空间区域。在较大蛋白质分子中，由多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成独立的结构单位。,主要的化学键(次级键):,氢键 离子键 疏水相互作用 又称疏水键，是稳定三级结构最主要的作用力 范德华力 二硫键（共价键）,A氢键； B.二硫键；C. 疏水作用；D.盐键；E. 范德华力,肌红蛋白 (Mb),一级结构:153

12、个氨基酸的排列顺序,二级结构:A-H 共8个-螺旋,之间以无规卷曲相连,三级结构:球状分子,亲水R基位于表面,疏水R基位于分子内部,形成疏水口袋,血红素位于口袋中,亚基之间的结合主要是疏水作用,氢键和离子键。,四、蛋白质的四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。,由2个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为同二聚体(homodimer)，若亚基分子结构不同，则称之为异二聚体(heterodimer)。,血红蛋白的四级结构

13、,某些蛋白质分子可进一步聚合成聚合体(polymer)。聚合体中的重复单位称为单体（monomer)，聚合体可按其中所含单体的数量不同而分为二聚体、三聚体寡聚体（oligomer)和多聚体（polymer)。,蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein,第三节,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构与功能的关系,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 痕量-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,分子伴侣(molecular chaperon),1. 防止新生肽链的错误折叠和聚合 2. 肽链快速折叠

14、成正确的维构型并成熟为具有完整结构和功能的蛋白质 HSP (heat shock protein),伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用,（二）一级结构是功能的基础 一级结构相似的蛋白质具有相似的高级结构与功能,对一级结构的比较,可以反应分子进化,一些广泛存在于生物界的蛋白质如细胞色素(cytochrome C)，比较它们的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系。,分子病:,蛋白质一级结构改变引起疾病称为“分子病”。 因为蛋白质一级结构中氨基酸排列顺序是由于遗传密码所决定，氨基酸的改变最根本原因是DNA碱基顺序的改变所致，因此了解一级结构的就能从分子水平诊断和治疗遗传病。,镰状红细胞贫血,例：镰刀形红

15、细胞贫血,关键部位氨基酸变换，严重影响蛋白质功能,二、蛋白质空间结构与功能的关系,（一）蛋白质的空间结构决定其生物学功能,蛋白质的功能不仅与一级结构有关，更重要的依赖于蛋白质的空间构象。,例：各种蛋白质前体的加工与激活 酶原的激活 激素前体的激活,组,丝,46,183,肠激酶,胰蛋白酶,胰蛋白酶原的激活过程,蛋白质分子可与某些小分子物质相互作用，致使构象发生轻微的改变，生物学效应随之发生较大的改变。这种作用称为变构作用或别构效应。,（二）蛋白质的空间构象变化与功能,肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基,血红素结构,血红素与蛋白质稳定结合主要靠两种作用：一是血红素分子中丙氨酸侧链与肽链中氨基酸侧链相

16、连，另一种作用肽链中组氨酸残基还与Fe2+形成配位结合。,血红蛋白(hemoglobin，Hb),血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。 Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同

17、效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity) 如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity),变构效应(allosteric effect),蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。,Hb与Mb在空间结构上的不同,决定 它们在体内发挥不同的生理功能,蛋白质构象改变可引起疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病

18、，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、克-雅病、疯牛病等。,疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,PrPc -螺旋,PrPsc -折叠,细胞型,致病型,疯牛病中的蛋白质构象改变,1982 , the Prion Theory,库鲁病(kuru),第四节,蛋白质的理化性质及其分离纯化,一、蛋白质的理化性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些

19、基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,蛋白质的等电点( isoelectric point, pI),（一）两性解离及等电点,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,颗粒表面电荷 水化膜,蛋白质胶体稳定的因素:,（三）蛋白质的变性与凝固,在某些理化因素的作用下，蛋白质中维系其空间结构的次级键（甚至二硫键）断裂，使其空间结构遭受破坏，造成其理化性质的改变和生物

20、学活性的丧失。,蛋白质的变性(denaturation),造成变性的因素: 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,蛋白质从溶液中析出的现象。,蛋白质沉淀,中性盐 有机溶剂 生物碱试剂 重金属离子,蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,蛋白质的凝固作用(protein coagulation),凝固是蛋白质变性后进一步发展

21、的结构。,变性的蛋白质容易沉淀，变性的蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性，凝固的蛋白质均已变性而且不再溶解。,应用举例: 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,（四）蛋白质的呈色反应,1. 茚三酮反应 2. 双缩脲反应 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,3酚试剂反应 蛋白质分子中酪氨酸的酚基与酚试剂作用，生成蓝色络合物,该蓝色物质在650nm下有强吸收。在一定范围内，蛋白质浓度与A650光吸收成正相关，因此可以用来进行蛋白质

22、定量,（五）蛋白质的紫外吸收光谱特性,蛋白质分子中酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸含有共轭双键，在280nm紫外光谱处，有特征性的最大吸收峰。 280nm的吸收值常用于蛋白质的定量测定。蛋白质浓度估算公式 C=1.45A2800.74A260来。,二、蛋白质的分离和纯化,破碎组织和细胞，将蛋白质溶解于溶液中的过程称为蛋白质的提取。 将溶液中蛋白质相互分离而取得单一蛋白组分的过程称为蛋白质的纯化。,（一）改变蛋白质的溶解度,盐析(salt precipitation)是用高浓度的中性盐将蛋白质从溶液中析出的方法。,盐析、有机溶剂沉淀、调节pH值、改变温度,硫酸铵、硫酸钠、氯化钠,对不同的蛋白质进行盐

23、析时，需要采用不同的盐浓度和不同的pH,有机溶剂沉淀法：酒精、甲醇、丙酮等能破坏蛋白质的水化膜使蛋白质沉淀，在等电点时沉淀的效果更好。 为防止蛋白质的变性，常需在低温条件下快速进行,（二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法,离心(centrifugation) 利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物质分离开的方法。,蛋白质溶液在高速离心时，由于离心力的作用，蛋白质会下沉，这就是蛋白质的沉降现象。 蛋白质分子在单位力场的沉降速度称沉降系数（S）。通常情况下，分子愈大，沉降愈快，沉降系数愈高。,2. 透析与超滤,应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,透析(dialysis),超滤法（ultrafiltration）,利用透析袋把大分子