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文档简介

1、基因工程的基本操作程序及基因工程的应用, 目的基因的获取, 基因表达载体的构建(核心), 将目的基因导入受体细胞, 目的基因的检测与鉴定,四 个 步 骤,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的基因,(二)、获取目的基因的常用方法,从基因文库中获取,利用PCR技术扩增,人工合成,1)基因文库?,1. 从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入到受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,称为基因文库,2)基因文库的种类:,种类,基因组DNA文库:含有一种生物的全部基因,部分基因文库:只包含了一种生物的部分基因, 如:cDNA文库,概念:

2、PCR全称为_,是一项在生物_复制_的核酸合成技术。,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,(2)利用PCR技术扩增目的基因,过程,1. 变性(95)双链DNA模板在热作用下,_断裂,形成_,氢键,单链DNA,2.复性 (55)温度降低, 与DNA模板结合,形成局部_。,双链,引物,3.延伸(72) 在 的作用下,从引物的 连接 ,合 成与模板互补的DNA 链。,3端,脱氧核苷酸,Taq酶,2、具体过程,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制(PCR扩增仪内),主要在细胞核内,热稳定的DNA聚合酶(Taq酶),大量的

3、DNA片段,形成整个DNA分子,解旋酶、 普通的DNA聚合酶等,3.人工合成,1)反转录法:,杂交双链 (单链RNA/单链DNA),单链DNA,双链DNA (cDNA),目的基因的mRNA,2)根据已知的氨基酸序列合成DNA法 :,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的脱氧核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,二、基因表达载体的构建(核心),使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,使目的基因能够表达和发挥作用,1、基因表达载体构建的目的?(P11),2、基因表达载体的组成,启动子,目的基因,终止子,标记基因,三、将目的基因导入受体细胞,目的基因进入_ _内,并且在

4、受体细胞内维持_ _和_ _的过程,转化:,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法:,易感染双子叶植物和裸子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力,原理:Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可以转移到受体细胞,并且整合到受体细胞染色体的DNA上。,农杆菌特点:,(1)农杆菌转化法( 采用最多),两次拼接?两次导入?,组织培养技术,(2)基因枪法 (3)花粉管通道法,显微注射技术(最常用,最有效),(3)将目的基因导入动物细胞,方法,受体细胞,常用受精卵,目的基因的表达载体提纯,取卵(受精卵),显微注射,受精卵发育,新性状动物,过程:,(2)将目的基因导入微生物细胞,过程:,C

5、a2+处理受体细胞,感受态细胞,重组表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA分子,思考:早期的基因工程用什么作受体细胞?为什么?,常用原核生物,因为原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。,方法,Ca2+处理法,用Ca2处理,增加细菌细胞壁的通透性,思考:为什么要用Ca2+处理受体细胞?,受精卵 体细胞,受精卵,细胞/个体,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注 射技术,用Ca2+处理成感受态细胞,采用基因工程的方法培育抗虫棉,下列导入目的基因的作法正确的是()A.将毒素蛋白注射到受精卵中B.将编码毒素蛋白的DNA序列,与质粒重组,导入细菌,用该细菌感染棉的体细胞,再进行组

6、织培养C.将编码毒素蛋白的DNA序列,与质粒重组,注射到棉的子房并进入受精卵D.将编码毒素蛋白的DNA序列,注射到棉受精卵中,BC,四、目的基因的检测与鉴定,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,1、导入检测,目的:,方法:,DNA分子杂交技术,从转基因生物中提取的基因组DNA,探针?,杂交的对象?,用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段,15N,15N,14N,探针,转基因生 物的DNA,变性,变性,14N,过 程,.首先取出转基因生物的基因组DNA .用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针。 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已

7、插入染色体DNA中,2、转录检测,目的:,检测目的基因是否转录出了mRNA,方法:,分子杂交技术,用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段,探针?,杂交的对象?,从转基因生物中提取的mRNA.,3、翻译检测,目的:,检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法:,抗原抗体杂交技术,从转基因生物中提取的蛋白质,抗原?,抗体?,将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产生的相应抗体,4、个体生物学水平的鉴定,抗虫鉴定、抗病鉴定、 活性鉴定等,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段,将两种生物的DNA分子的单链放在一起,如果这两个单链具有互补的碱基序列,那么,互补的碱基序列就会结合在一起,形成杂合双链

8、区;在没有互补碱基序列的部位,仍然是两条游离的单链。,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理法 目的基因的检测与鉴定 检测:是否插入、转录、翻译 鉴定:个体生物学水平的鉴定,基因工程的应用,1.植物基因工程硕果累累,抗虫转基因植物,方法:,目的基因:,从某些生物中分离出具有杀虫活性的基因,将其导入作物中,使其具有抗虫性,Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等,成果:,转基因抗虫棉;转基因抗虫水稻等。,

9、抗虫棉(左)和普通棉(右)的叶子,转基因抗虫水稻(绿色植株)与对照(黄色枯萎植株),1.植物基因工程硕果累累,目的基因:,病毒外壳蛋白基因(CP基因) 病毒的复制酶基因,成果:,抗烟草花叶病毒的转基因烟草 抗病毒的转基因小麦、甜椒、番茄等。,1.植物基因工程硕果累累,抗病转基因植物,抗病毒基因:,几丁质酶基因 抗毒素合成基因,抗真菌基因:,引起植物生病的病原微生物有:病毒、真菌和细菌,1.植物基因工程硕果累累,抗逆转基因植物,成果:,A.利用调节细胞渗透压的基因,提高作物抗旱和抗盐碱能力; B.将鱼的抗冻蛋白基因转入番茄,提高番茄的抗冻能力。 C.将抗除草剂基因导入农作物中,在喷洒除草剂时,杀

10、死杂草而不杀死农作物。,1.植物基因工程硕果累累,利用转基因改良农作物品质,成果:,A.将富含赖氨酸的蛋白质的编码基因导入玉米,获得的转基因玉米赖氨酸含量提高30。 B.将控制番茄成熟的基因带入番茄,获得转基因延熟番茄,储存期可以达2个月。 C.将与植物花青素有关的基因导入矮牵牛中,转基因矮牵牛出现颜色变异。,2.动物基因工程前景广阔,用于提高动物生长速度,目的基因?举例说明,用于改善畜产品品质,举例说明,用转基因动物生产药物,如何操作?生产出哪些药物?,用转基因动物做器官移植的供体,如何操作?,2.动物基因工程前景广阔,用于提高动物生长速度,目的基因:,生长激素基因,例如:,将外源生长激素基

11、因导入鲤鱼体内,9个月后转基因鲤鱼比对照组重1.5Kg。,肠乳糖酶基因,例如:,将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组,使转基因奶牛中乳糖含量大大降低。,用于改善畜产品品质,目的基因:,2.动物基因工程前景广阔,药用蛋白基因,用转基因动物生产药物,目的基因:,过程:,获取目的基因 (药用蛋白基因),构建基因表达载体 (药用蛋白基因与乳腺蛋白基因启动子等调控组件重组),显微注射 (哺乳动物受精卵中),形成胚胎,将胚胎送入母体动物,发育成转基因动物 (只有在产下的雌性动物个体中,转入的基因才能表达),动物进入泌乳期 (分泌的乳汁中包含所需要的药物),2.动物基因工程前景广阔,乳腺生物反应器:,用转基因动物生

12、产药物,指以转基因雌性动物个体的乳腺分泌乳汁来生产所需药品。,优点:,产量高 质量好 成本低 易提取,成果:,抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素、抗胰蛋白酶,2.动物基因工程前景广阔,用转基因动物做器官移植的供体,供体动物:,猪,存在难题:,解决方法:,将供体基因组导入某种基因调节因子,以抑制抗原决定基因的表达,或设法除去抗原决定基因,再结合克隆技术,培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。,免疫排斥,(T细胞),3. 基因工程药物,在传统的药品生产中,某些药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。 如胰岛素从生物胰腺中提取,干扰素从血液中提取。,传统生产方法的缺点,由于受原料来源的限制,数量少且

13、价格十分昂贵。,可利用什么方法来解决上述问题?,利用基因工程方法制造“工程菌”,可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。,一般临床上使用的胰岛素主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取,每100kg胰腺只能提取45g胰岛素。用该方法生产的胰岛素产量低,价格昂贵,远不能满足社会需要。 1979年,科学家将动物体内的胰岛素基因与大肠杆菌DNA分子重组,并在大肠杆菌内实现了表达。,基因工程药品 胰岛素,3. 基因工程药物,干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。几乎能抵抗所有病毒引起的感染,是一种抗病毒的特效药。此外对治疗某些癌症和白血病也有一定疗效。 传统的干扰素生产方法是从人血液中的白细胞内提取,每30

14、0L血液只能提取出1mg干扰素。,基因工程药品 干扰素,3. 基因工程药物,治疗侏儒症的唯一方法,是注射生长激素。而生长激素的获得很困难。以前,要获得生长激素需解剖尸体,从大脑的底部摘取垂体,并从中提取生长激素。 现利用基因工程方法,将人的生长激素基因导入大肠杆菌中,使其生产生长激素。 人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素,相当于6万具尸体的全部产量。,基因工程药品 生长激素,3. 基因工程药物,目前我国生产的基因工程药物有白细胞介素2、干扰素、乙肝疫苗等。,40,4. 基因治疗,基因治疗:,基因治疗是把正常基因导入病人体内,使该基因的表达产物发挥功能,从而达到治疗疾病的目的。这是治疗遗传病的最有效的手段。,载体 治疗基因,受体细胞,重组受体细胞,患者 体内,导入,形成,体外培养后导入,直接导入,体外基因治疗,体内基因治疗,体外基因治疗:从病人体内获取某种细胞进行培养,然后,在体外完成基因转移,再筛选成功转移的细胞扩大培养,最后重新输入患者体内。,4. 基因治疗,体外基因治疗,例如:,复合型免疫缺陷症的体外治疗,直接原因:,缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA),根本原因:,腺苷酸脱氨

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