(sop-qc-003-03)_lowry法检测蛋白质含量标准操作规程[1]

Lowry 法检测蛋白质含量 1. 目的： 保证产品蛋白质含量测定按规范进行和检定结果的准确可靠。 2. 依据： 2005 年版中华人民共和国药典（三部） 。 3. 试剂与水： 所有试剂为分析纯（AR） ；水为蒸馏水或超纯水。 4. 器皿与耗品： 所有玻璃器皿为清洁级，37 度烤干。 tube、tip：一次性使用，容量瓶， 96 孔酶标板 ， 5. 仪器设备： 酶标仪： 旋涡混匀器。 6. 溶液的配置： 6.1. 4%碳酸钠溶液：称取 4g 碳酸钠, 加水 90ml, 搅拌，使完全溶解，并定溶至 100ml。贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为一个星期。 6.2. 0.2mol/L 氢氧化钠溶液：称取 0.8 g 氢氧化钠, 加水 90ml, 搅拌，使完全溶解，并定 溶至 100ml。贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为一个星期。 6.3. 0.04 mol/L 硫酸铜溶液：称取 1g 硫酸铜(CuSO 4 5H2O) (分析纯), 加水 90ml, 搅拌， 使 完全溶解，并定溶至 100ml。贴上标贴，室温储存。此溶液有效使用期限为一个 星期。 6.4. 0.1mol/L 酒石酸钾(或 0.1mol/L 酒石酸钠)：称取 2g 酒石酸钾(或酒石酸钠), 加水 90ml, 搅拌，使完全溶解，并定溶至 100ml。贴上标贴，室温储存。此溶液有 效使用期限为一个星期。 6.5. 碱性铜液：临用前取试剂 6.1（Na 2CO3）和 6.2（NaOH）各 5 ml，试剂 6.3（硫酸铜） 和 6.4（酒石酸钾）各 0.1 ml 混匀配制而成，即用即配。 6.6. 酚试剂： 商品化：注意酚需要稀释到 1mol/L 6.7. 标准品来源： 人血清白蛋白标准品 HSA(中检所). 6.8. 配制标准品标准程序： 参照蛋白国家标准品使用说明书 取人血清白蛋白（HSA）一支（ 21.24mg） ，先用超纯水溶解，定容到一洁净的 25ml 容量瓶中，摇匀，取 23.54ml，再用一洁净的干燥的 25ml 容量瓶定容，即为浓度为 800ug/ml 浓度的标准品。用 2ml tip 管分装，250ul/支，冻干。保存于-20 度 使用时，取 1 支冻干标准品，加入 0.5ml 超纯水，配制成 200ug/ml 标准品备用。 6.9. 标准品规格 冻干的标准品每管 200ug，加入 0.5ml 超纯水配成 200ug/ml。 （每次实验需要 2 支） 6.10. 标准品的鉴定 用原有的标准品做标准曲线，随机取三支本分装品为样品，测定样品蛋白含量，得 XSD（其中 X 单位为 ug/ml）与 RSD, 当 X 值为 98-102，且 RSD 值小于等于 2% 者，认为该标准品的标示浓度为 200ug/ml。 6.11. 工作标准品的配制 取冻干标准品一支（200 ug）加入 0.5ml 纯化水，完全溶解，混匀, 标注为 200ug/ml 7. 程序： 7.1. 样品的处理 7.1.1. 一次检测过程包括标准不能超过 20 个样品。若是原液或成品, 每个样品需做 2 个或 3 个稀释度： V 水 V 原 （d1） 其中 V 水 为需要加入纯化水的体积，V 原 为稀释前样品的体积，d 为稀释度 7.1.2. 待测样品如为冻干品，则根据标示量稀释至 1mg/ml，再稀释 10 倍；待测样品如为未 知浓度的样品，可以根据 bradford 标准品颜色目测后稀释样品。 7.1.3. 待测样品均需溶解后先离心，再进行稀释和检测操作。 7.1.4. 稀释后的样品需做同样的三个反应体系。 7.2. 标准曲线的制备（见 6.11 工作标准品的配制） 标准操作规程 Standard Operation Procedure 吉林大学研发中心 lorry 法测蛋白质含量标准操作规程 编号 SOP-QC-003-02 7.3. 测定步骤（操作温度不能高于室温，每 2 个加样时间间隔均匀，为 15 秒） 7.4. 使用酶标板测 OD 值 每管样品（包括标准品）取 200ul 加在酶标板上，每管做三复孔，使用酶标仪检测 620nm 比色波长（单波长） ，并计算得出蛋白浓度数值。酶标仪的使用及设置参见 酶标仪使用标准操作规程 8. 剩余样品处理 8.1. 若为发酵样品或蛋白样品，稀释后的样品应保存于 4冰箱一天 8.2. 反应后的样品测完后可以直接丢弃。 9. 结果计算与分析： 9.1. 结果判定标准 9.2. 标准曲线的相关系数均 r 值(r0.99) ；若是 r0.99 的话, 实验需要重新做; 9.3. 同一样品，同一稀释度，若是三个不同的反应体系得出结果 RSD10 的话,也需要重 新检测。 9.4. 若是样品分不同稀释度得出的结果 RSD10 的话,也需要重新检测。 9.5. 数据的取舍标准。 管号 1 2 3 4 5 6 配制工作标准品浓度(ug/ml) 200 160 120 80 40 0 200ug/ml 标准品加入量（ul） 200 160 120 80 40 0 dd H2O 加入量（ul） 0 40 80 120 160 200 步骤 内容 标记管号 1 2 3 4 5 6 N 工作标准品浓度(ug/ml) 200 160 120 80 40 0 加入工作标准品 200ul 加入稀释后样品(ul) 200 加入碱性铜液 1ml 混匀，室温静置 10 分钟 加入酚试剂 1ml 混匀，室温静置 30 分钟 9.5.1. 根据最高及最低浓度标准品 OD 值确定检测样品 OD 值的有效范围。 9.5.2. 用有效范围内同一样品不同稀释度所得的蛋白浓度计算它们的平