手足口病rt-pcr检测标准操作程序_tiangen_1_2

手足口病 RTPCR 检测标准操作程序 （试用） （2008 年 5 月 22 日第 1 版，2008 年 5 月 29 日修改） 内部标准编号： 检测项目： 肠道病毒 EV71、CA16，其他肠道病毒 检测方法： RTPCR PCR 仪 器： BioRad iCycler 1. 检测原理 根据已知肠道病毒5UTR区基因序列及EV71、CA16的VP1VP3基因序列，设计 特异性引物（PE、EV71、CA16），通过Nested RTPCR扩增基因片段，检测标本中是否 存在肠道病毒EV71、 CA16和其他肠道病毒。所用引物序列、扩增产物大小和配制如下： 引物 核酸序列(53) 产物长度 加 DEPC 水量(uL) （1 OD 配制 25 uM） PE2 TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C 156 PE1 ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC 116 bp 180 EV71-S GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC 196 EV71-A ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC 226 bp 208 CA16-S ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC 220 CA16-A TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG 208 bp 208 2. 应用的范围 检测血清、血浆、粪便、咽拭、疱疹液、脑脊液等标本中肠道病毒 EV71 型和 CA16 2 型病毒基因片段。 3. 标本处理 3.1 粪便标本处理： 3.1.1 将 1.5ml Eppendorf 管上标记标本号; 3.1.2 每一管中加入 900ul 生理盐水、100ul 氯仿; 3.1.3 在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约 0.1g 约绿豆大小，加入标记好的离 心管中，剩余原始标本最好留在原容器中并冻存于 - 20。 3.1.4 确保拧紧离心管，用机械振荡器剧烈振荡 20min。 3.1.5 1500g* （约 3500 转）离心 20 分钟。 3.1.6 将每一份标本上清吸入新 1.5ml Eppendorf 管中。 注意：若上清不清澈，应再用氯仿处理一次。以上 标本处理方法适用于从患者排泄 物、呕吐物（均简称样品）中提取病毒 RNA。 3.2 咽拭子标本处理 咽拭子要在保存液中充分搅动（40 下左右）或用机械振荡器剧烈振荡 510min， 以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后 10000rpm 离心 20min 或 4 静置 10min，取上清吸入 2 个有外螺旋盖的标记好的 冻存管中。 注意：以上标本处理方法适用于从疱疹液拭子、肛拭子（均简称样品）中提取病毒 RNA。脑脊液、血清标本不需要处理可直接用于 RNA 提取。 3.3 提取病毒 RNA 模板 应用 RNA 提取试剂盒（TianGEN 公司产品，Cat. No：DP315-R）方法 试剂准备： a 打开新试剂盒，需将 310uL Rnasefree ddH2O 加入 310ug Carrier RNA 获得 1 ug/uL 的溶液。溶解后需分装保存于-20。 （每管分装 56uL 可做 10 次提取）。此溶液反复冻融 不能超过 3 次。 河南省 CDC 传染病预防控制所分子生物学实验室病原检测标准操作程序 内部标准 第 3 页 共 5 页 b Carrier RNA 工作液配置：根据样品的数量计算所需裂解液 RL 和 Carrier RNA 溶液 的体积，将裂解液 RL 与 Carrier RNA 溶液颠倒混匀，即得到 Carrier RNA 工作液。为避 免溶液出现气泡现象，请勿使用涡旋振荡。 N 0.56 mLY mL Y mL 10 uL/mL=Z uL N样品数目；Y裂解液 RL 溶液体积；Z需加入 Carrier RNA 溶液体积 注意 Carrier RNA 冻干粉不能直接溶解于裂解液 RL 中，必须先溶解在 Rnasefree ddH2O 中，再溶解至裂解液 RL 中。溶解后 2-8最多能保存 48 小时，最好现用现配。 c 缓冲液 GD、漂洗液 RW 为浓缩液，第一次使用前加入无水乙醇（试剂瓶上标注的量） 混匀，室温可储存 1 年。 - 提取病毒 RNA 模板： 3.3.1 吸取 560 l 含有 Carrier RNA 的 RL 到 1.5ml Eppendorf 离心管中。 3.3.2 加 140 l 1 标本到上述离心管中，回旋振荡 15 秒。 3.3.3 室温（1525）孵育 10 min。 3.3.4 短暂离心一次。 3.3.5 加 560 l 乙醇（96100）到离心管中，盖上离心管帽，回旋振荡 15 秒。短暂离 心一次。 3.3.6 从离心管中吸取 630 l 溶液至 Rnase-free 吸附柱 CR2 中，注意不要滴到柱子边 缘上。盖上离心管帽，6000g（8000rpm）离心 1 min。用移液器把吸附柱套管中的 滤液吸出弃掉，将套管套回原吸附柱中。 3.3.7 重复第 6 步的步骤。 3.3.8 加 500 l 缓冲液 GD，盖上离心管帽，6000g （8000rpm）离心 1 min。用移液器把吸 附柱套管中的滤液吸出弃掉，将套管套回原吸附柱中。 3.3.9 加 500 l 漂洗液 RW，盖上离心管帽，6000g（8000rpm ）离心 1 min。用移液器把吸 附柱套管中的滤液吸出弃掉，将套管套回原吸附柱中。 3.3.10 13400g（12000rpm）离心 3 min。用移液器把吸附柱套管中的滤液吸出弃掉，将套管 套回原吸附柱中。 3.3.11 可选：打开吸附柱盖子，室温放置 3min，使吸附膜完全变干。 3.3.12 将吸附柱放入一个新的 1.5ml 无 RNA 酶离心管中，打开柱子帽，加入 60l Rnasefree ddH2O，盖上盖子，在室温孵育 5min，6000g（8000rpm）离心 1 min。 3.3.13 提取的病毒 RNA 模板可立即进行逆转录，或贮存于70 备用。 4. RTPCR 反应 4.1 准备引物 4.1.1 引物溶解方法 4.1.1.1 将盛放冻干引物干粉的 Eppendorf 离心管放入离心机，插入离心管时应注意放 4 置方向，10000rpm 离心 10min。 4.1.1.2 小心取出离心管，放置到合适的 试管架上，在 PCR 实验室的“ 准备间”溶解稀释 引物。 4.1.1.3 小心打开 Eppendorf 管，按照 4.2“引物加水配制表”加入 RNasefree ddH2O， 用枪头仔细搅刮或吹打离心管底部引物沉淀处，使引物充分溶解至水中，关闭 离心管盖，在回旋振荡器上振荡 10min。短 暂离心，使管壁液体集中到管底。 4.1.2 引物加水量 引物加水稀释，配制成 25uM 的母液，各引物每管（1 OD）加水量如下表 引 物 加 水 配 制 表 引物名 加水量 引物名 加水量 引物名 加水量 PE1 156 uL EV71A 208 uL CA16A 208 uL PE2 180 uL EV71S 196 uL CA16S 220 uL 4.2 一步法逆转录 PCR（RTPCR）（中国 CDC 全国学习班推荐方法） 配制如下逆转录及 PCR 反应体系（TianGen 公司 RTPCR 试剂盒） PE2/PE1 EV71-SEV71-A CA16-S CA16-A 组分名称 单标本 DEPC H2O 25.3 uL 10RT-PCR buffer 5.0 uL dNTPs(2.5mM) 2.0 uL 5RT-PCR enhancer 10 uL Rnasin(40U/ul) 0.5 uL Hotmaster Taq (2.5U/ul) 2.5 uL Quant RTase 0.5 uL 上游引物（25uM） 0.6 uL 下游引物（25uM） 0.6 uL 模板 RNA 3 uL 总体积 50 uL 程序：5040 分钟；945 分钟； 9430 秒，5040 秒，6550 秒，35 个循环； 6510 分钟。 （总时间约 170 分钟） 河南省 CDC 传染病预防控制所分子生物学实验室病原检测标准操作程序 内部标准 第 5 页 共 5 页 5. 结果判断 PCR产物行2%琼脂糖凝胶 电泳，出 现相应长度的扩增产物即为该基因检测阳性。 （产物：EV71S-EV71A 引物：226bp；CA16S-CA16A 引物：208bp; PE2PE1 引物：116bp ） 6. 检测的局限性 待查 7. 参考文献 7.1 中国疾控中心网站，手足口病专题， EV71、CA16检测方案 7.2 其他中外文文献 第 1 版制定人：马宏 杜燕华 制定时间：2008 年 5 月 22 日 第 1 版修订人：马宏 杜燕华 修订时间