大鼠灌服复方丹参方后血清中丹参素的测定

大鼠灌服复方丹参方后血清中丹参素的测定 潘桂湘 ，张伯礼，高秀梅 （天津中医学院中医药研究中心，天津 300193） 摘要 目的：了解大鼠 ig 复方丹参方后水溶性成分的吸收情况，建立大鼠血清中丹参 素的含量测定方法。方法：采用液液萃取法对血清样品进行预处理，以对羟基苯甲酸为内标， 甲醇- 乙腈 -0.5%醋酸（2.5：3.5：94）为流动相，用高效液相色谱法于 281nm 检测。结果：大 鼠 ig 复方丹参方后在血清中检测到丹参素，用所建立的方法绘制了其经时血药浓度曲线；而 原儿茶醛则未在血清中发现，检测到的是一个保留时间稍前于原儿茶醛的未知化合物。结论： 大鼠灌服复方丹参方后，丹参素可经胃肠道吸收入血，呈快吸收慢消除的过程。 关键词 复方丹参方；丹参素；高效液相色谱法；体内药物分析 复方丹参方由丹参、三七及冰片组成，具有活血化瘀，理气止痛之功效，是临床治疗 冠心病、胸闷、心绞痛的常用中药处方。方中的化学成分根据其理化性质和药理作用的差 异，可将之分为丹参水溶性成分、丹参脂溶性成分和三七皂苷类成分三大类。丹参水溶性 成分含有多种酚酸类化合物，该类成分具有很强的抗脂质过氧化、抗血栓等作用 1，可能 是复方丹参方中的主要活性部位。 传统中药多为口服制剂，其有效物质往往以血液为介质而输送到靶点产生作用。就此 而言，给药后的血清才是真正起作用的“粗的药物” 2。所以，中药的药效物质基础应该 在给药后的血清组成中进行探讨 3。虽然近年来国内对复方丹参方的研究较多，但对该方 药效物质基础进行深入探讨的研究则相对很少。通过研究复方丹参方动物给药后血清中的 成分及其相应的药理作用，则可以更直接地了解到复方中真正起作用的化学物质基础。所 以本文对大鼠灌服复方丹参方后丹参水溶性成分的吸收状况进行了研究，并建立了血清中 丹参素的 HPLC 测定方法，为进一步阐明其药效物质基础提供科学的依据。 1 材料与方法 1.1 材料 仪器 HP1100 高效液相色谱仪，G1311A-四元泵，G1322A-脱气机，G1316A- 柱温箱， 1314A-UV 可变波长检测器，HPRev.A.0501 化学工作站。 试药 甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，冰醋酸、乙酸乙酯为分析纯，丹参素、原儿茶 醛对照品（中国药品生物制品检定所） ，对羟基苯甲酸（化学纯） ，三氯醋酸（分析纯） ，复 方丹参方药液（取丹参和三七提取物适量，加蒸馏水配制成生药量比为 10：6 的药液） 。 动物 SD 大鼠，雌雄各半，体重(200 10)g，北京维通利华实验动物中心提供。 1.2 色谱条件 Hypersil C18（5m）4.6mm250mm 色谱柱，甲醇- 乙腈-0.5% 醋酸（2.5：3.5：94）为流动 相，流速为 1.0mLmin-1，检测波长为 281nm，色谱图见图 1。 1.3 样品的处理与测定 精密量取血清样品 1.0mL，加入 1%醋酸 50L，内标溶液 50L，10% 三氯醋酸溶液 200L，用涡旋混合器混旋 1min，12000r min-1 离心 10min。 将上清液转移至具塞尖底离心试管中，用 4mL 乙酸乙酯旋涡混合提取 1min，3000 rmin-1 离心 2min，分取有机层，于 45水浴上通 N2流挥干。临用前残渣用甲醇 50L 溶解，超 声 1min，旋涡混合 1min，离心（12000 rmin-1）10min，取上清液 10L 进样，以内标工 基金项目：国家重点基础研究规划项目(G199944054403) 作者简介：潘桂湘(1976-)，男，硕士，研究方向为药物分析。TelEmail： 作曲线法 4求算丹参素的血药浓度。 1.4 标准曲线的绘制 1.4.1 标准贮备液配制 精密称取 4.0mg 丹参素于 10mL 容量瓶中，用 1%醋酸定容至刻度， 然后取适量用 1%醋酸稀释成浓度为 0.016，0.04，0.08，0.16，0.24，0.8mg mL-1 的丹参素 标准溶液。另精密称取 4.1mg 对羟基苯甲酸于 10mL 容量瓶中，用 1%醋酸稀释至刻度，再 取 1mL 稀释至 10mL 作为内标溶液。 1.4.2 标准曲线的制备 精密量取空白血清样品 1.0mL，加入不同浓度的丹参素标准溶液 50L，内标溶液对羟基苯甲酸 50L，10%三氯醋酸溶液 200L，按“1.3 样品的处理与 测定”方法进行处理与测定。以丹参素与内标物的峰面积比值（Y）为纵坐标，丹参素浓 度（X）为横坐标，用最小二乘法进行线性回归。 1.5 给药方案与样品采集 SD 大鼠随机分组，每组 3 只（即每个取样时间点 3 只） ，实验 前 12h 禁食，不禁水。除空白组大鼠外，各组大鼠按 2.5mL100g-1 剂量灌服复方丹参方药 液。大鼠于灌服前和灌服后 15，30，45，60，75，90，120，180，240，360min 心脏采血， 37水浴温孵后，离心 10min（3000 r min-1） ，分离血清。 2 结果 2.1 丹参素经时血药浓度测定结果 取血清样品 1.0 mL，按“1.3 样品的处理与测定”进 行操作，得大鼠 ig 复方丹参方药液后丹参素的经时血药浓度，结果见表 1。 表 1 丹参素经时血药浓度（n=3） 取血点 取血时间min 15 30 45 60 75 90 120 180 240 360 血药浓度g mL- 1 703.6 599.7 187.2 183.7 122.5 128.5 65.9 39.4 44.8 26.7 2.2 精密度试验 取空白血清 1.0mL，加入不同浓度的丹参素标准溶液制成高、中、低 3 种不同浓度样品，按与血清样品相同的处理方法进行处理，测定日内精密度和日间精密度， 结果见表 2。 表 2 丹参素血药浓度测定方法的精密度考察（n=5） RSD/%加入量/g mL-1 日内精密度 日间精密度 40 1.4 3.0 160 3.1 4.3 800 4.2 5.6 2.3 线性关系 按“标准曲线的制备”方法测得丹参素与内标物的峰面积比值（Y）与丹参 素浓度在 16800gmL -1 范围内线性关系良好，回归方程为 Y = 5.176X+0.118，r = 0.9990。 2.4 回收率试验 试验方法同精密度，按测得量与加入量求算方法的回收率，结果见表 3。 表 3 丹参素血药浓度测定方法的回收率考察（n=5） 加入量/g mL-1 测得量/g mL-1 回收率 /% RSD/% 平均回收率/% 35 34 97.1 2.1 120 117 97.5 3.4 800 789 98.6 4.3 97.7 3 2.5 最小检测限 将适量丹参素溶液加入到空白血清中，按“1.3 样品的处理与测定”进行 操作，进样，以 S/N10 为定量限，S/N3 为检测限，测得丹参素最低定量浓度为 0.15g mL-1，最小检测浓度为 0.05g mL-1。 3 讨论 3.1 在进行样品预处理过程中，曾比较了液- 液萃取与液固萃取的回收率情况。结果显示液 固萃取的萃取回收率要低于液液萃取。其原因可能在于丹参素属弱酸性成分，虽调节了溶 液的 PH 值，但它在 C18 固相萃取小柱上的吸附仍然不完全，且其极性较大，可能在洗脱除 杂过程中有部分的损失。 3.2 血清样品先用三氯醋酸处理，然后再进行液液萃取操作，这两步处理一方面可以使蛋 白去除更为完全，另一方面又调节了溶液的 PH，使复方丹参方中丹酚酸类成分处于游离状 态，有利于提取的完全。 3.3 大鼠灌服复方丹参方后丹参素的经时血药浓度呈现快吸收慢消除的特点：给药 15 分钟 即达到血药浓度峰值，表明丹参素在大鼠体内能够迅速吸收，起到速效的作用。随后在 16 个小时丹参素缓慢消除，可能是丹参素分布到组织后停留的时间较长造成，也可能是 复方中其它丹参酚酸类成分在胃肠道或肝脏中代谢转化成丹参素所致。 3.4 由色谱图 1 可见 tR=19min 左右处有一色谱峰，其保留时间稍小于原儿茶醛的 tR 值，且 该峰的峰值随给药时间的不同呈不规则的变化。由于代谢物一般较原形药物极性增大，在 用反相柱进行分析时保留时间提前，因而提示该峰有可能为原儿茶醛或其它酚酸类成分的 代谢产物，具体还有待于实验的进一步证实。 参考文献 1 黎莲娘，张均田.丹参及其同属植物的水溶性活性成分.医药研究通讯，2001，30（7）：2. 2 贺玉琢.日本汉方药“血清药理学” 、 “血清药化学”的研究概况.国外医学 中医中药分册， 1998，20（5）：3. 3 张礼和.我对中药复方有效成分研究的一些看法.化学进展，1999，11（2）：186. 4 曾经泽.生物药物分析.北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社，1998. Determination of Danshensu in Rat Serum after Oral Administer Compound Salvia Recipe PAN Gui-xiang, ZHANG Bo-li, GAO Xiu-mei (Tianjin College of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193) Abstract Objective: To investigate the absorption of the water soluble components of Salvia miltiorrhiza and establish methods to determine Danshensu in rat serum after ig compound Salvia recipe. Method: Used liquid-liquid extraction to deal with the serum, then determined the sample by high-performance liquid chromatography. The conditions for HPLC were as the following: the mobile phase, CH3OH- CH3CN- 0.5%CH3COOH (2.5:3.5:94) with a flow rate of 1.0 mLmin-1; detection wavelength, 281nm; internal standard, 4-hydroxy-benzoic acid. Result: Danshensu and an unknown compound whose reserved time was little shorter than protocatechuic aldehyde were found in the rat serum after ig compound Salvia recipe, while protocatechuic aldehyde werent found in the serum Conclusion: Danshensu can be absorbed into blood after ig compound Salvia recipe. Key Words：Compound Salvia Recipe；Danshensu ；HPLC；Biopharmaceutical Analysis 5 min0 10 20 30 40 mAU -2.502.557.5 1012.51517.5 123 t/min min10 20