病毒感染的检查方法与防治原则.ppt

1,病毒感染的检查方法 与防治原则 南方医科大学 公共卫生与热带医学学院 微生物学系 张其威 PhD Email： QQ: 3910035,第25章,2,病原学诊断的意义,有助于临床治疗（抗生素、干扰素等） 为控制病毒学疾病的流行提供实验依据（疫苗等）,3,第一节 病毒感染的检查,4,病毒感染的检查,检测内容,查病毒,查特异性抗体,病毒颗粒 病毒抗原（如血凝素） 病毒核酸 （PCR） 病毒酶类：如逆转录酶,电镜直接观察 光镜检查包涵体 分离培养,（如 IgM、IgG）,5,一、标本的采集与送检,原则基本与细菌相似，但应注意： 1.标本用“双抗”（2000-10000U）或两性霉素B（2ug/ml)处理 2.低温保存，尽快送检（冰块，CO2） 3.血清学诊断采双份血清（发病初，2-3周）,6,二、病毒的分离与鉴定,（一）病毒的分离培养 细胞培养（cell culture） 鸡胚接种（egg inoculation） 动物接种（animal inoculation）,7,二、病毒的分离与鉴定,一般程序：,标本,无菌处理,动物接种 鸡胚培养 细胞培养,指标阳性 指标阴性,病毒鉴定,盲传23代,指标阴性,病毒阴性,8,（一）病毒的分离培养 1.细胞培养（简述） 单层细胞培养（monolayer cell culture） 分类 悬浮细胞培养（suspended cell culture） 原代细胞（primary cell） 细胞种类 二倍体细胞（diploid cell） 传代细胞系（continuous cell line）,9,病毒的细胞培养,细胞培养瓶,单层细胞,10,1.细胞培养,(1)原代和次代细胞培养,组织 组织块 分散的单个细胞 单层细胞,剪碎 培养基,(原代细胞),单层细胞,(次代细胞),传代培养,蛋白酶,11,特点：对多种病毒敏感 生长能力有限（20代）, 获取成本高 可携带潜伏病毒（EB）,1.细胞培养,(1)原代和次代细胞培养,12,(2)二倍体细胞培养 体外分裂50100代仍保持二倍体染色体数目，可用于病毒分离和疫苗生产。,特点：对多种病毒敏感 不带异种蛋白(人源性) 不带病毒，无致瘤潜能 可传50-100代左右,1.细胞培养,13,(3) 传代细胞培养,特点：对多种病毒敏感性高 繁殖能力高，传代时间长 有致癌危险，不能用于疫苗生产 （由肿瘤细胞或二倍体细胞突变而来）,1.细胞培养,14,2.鸡胚培养 采用孵化914天的鸡胚 绒毛尿囊膜（allantocherion） 痘苗病毒、人类疱疹病毒 尿囊腔（allantoic cavity） 接种部位 流感病毒、腮腺炎病毒 羊膜腔（amniotic cavity） 流感病毒的初次分离 卵黄囊（yolk sac） 嗜神经病毒,15,尿囊腔,16,2、鸡胚培养,优点：易管理，不带微生物，成本较低 缺点：操作程序复杂,17,18,19,3.动物接种 应用：尚无敏感细胞的病毒培养（HCV等） 动物：兔、鼠、黑猩猩、猴等 优点：结果易观察，可建立动物模型 缺点：有饲养条件要求，费用高，动物 体内常带有潜伏病毒，安全性要求高,20,1病毒增殖鉴定 (1)细胞病变效应（cytopathic effect, CPE ） 细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等（多数病毒）； 形成多核巨细胞或称融合细胞（麻疹病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒等）； 在培养细胞中形成包涵体（狂犬病病毒、麻疹病毒等）。,（二）病毒的鉴定,21,22,细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落,(1)细胞病变效应(cytopathic effect, CPE),23,麻疹病毒感染细胞,呼吸道合胞病毒感染细胞,形成多核巨细胞或称融合细胞,(1)细胞病变效应(cytopathic effect, CPE),24,形成包涵体(inclusion body),(1)细胞病变效应(cytopathic effect, CPE),25,腮腺炎病毒感染细胞,(2)红细胞吸附（hemadsorption）,病毒囊膜表面血凝素(HA) 红细胞表面HA受体,26,(3)干扰现象（interference）,风疹病毒人胚肾细胞 病毒增殖，CPE(),埃可病毒人胚肾细胞 病毒增殖，CPE(),人胚肾细胞,风疹病毒？ 埃可病毒（+）,CPE(-)风疹病毒(+) 埃可病毒(-) CPE(+)风疹病毒(-) 埃可病毒(+),27,(4)细胞代谢改变 细胞代谢变慢 pH改变 （adenovirus）,28,2.病毒形态学鉴定,电子显微镜：设备、操作复杂，应用受限 光学显微镜：可见大病毒（痘类病毒）， 对一般病毒检测意义不大,29,3.病毒血清学鉴定,鉴定病毒种、型、亚型 (1)血凝抑制试验（hemagglutination inhibition test）正粘病毒型与亚型鉴定 病毒鸡红细胞凝集（血凝试验/血凝效价） 病毒特异性抗体鸡红细胞不凝集 （血凝抑制试验）,30,31,(2)免疫标记法（FIA、EIA/ELISA、RIA） 多种病毒鉴定 (3)凝胶免疫扩散试验(gel immuno- diffusion test) 多种病毒鉴定,3.病毒血清学鉴定,32,4.病毒分子生物学鉴定,抗原变异 病毒基因的鉴定 核酸扩增 核酸杂交 基因芯片 基因测序,33,（三）病毒数量与感染性测定,1.血凝试验：病毒总量（活病毒死病毒）,2.蚀斑形成试验 （plaque formation test） 3.50组织细胞感染量 （50 tissue culture infectious dose, TCID50）,感染性病毒量(PFU),34,35,Calculate TCID50. Formula: TCID50/100ul=(% positive value 50%)50%/(% positive value 50%)(% positive value 50%) #： 10-fold dilution, it is 1.,36,(四) 新病毒的鉴定,核酸类型的测定(PCR) 理化性状的检测（如对干、热、酸、脂溶剂的敏感性等） 形态学鉴定 （电镜） 血清学鉴定 （中和试验） 基因测序和生物对比 （序列同源性分析）,37,三、病毒感染的血清学诊断,应用于： 采取标本分离病毒为时已晚 目前尚无分离此病毒的方法或难以分离的病毒 为证实所分离的病毒的临床意义 进行血清流行病学调查等,38,1.中和试验（neutralizing test）,病毒中和抗体 病毒失去感染性 特点：特异性高，抗体维持时间长 应用：人群免疫情况的调查 临床诊断少用,39,2.补体结合试验 （complement fixation test）,用已知病毒可溶性补体抗原检测病人血清中相应的补体抗体 特点：特异性低，抗体出现早，消失快 应用：近期感染指标。,40,四、病毒感染的快速诊断,数小时内出结果 病毒颗粒 病毒成分（抗原或核酸） 早期抗体检测（IgM）,41,（一）形态学检查,电镜和免疫电镜检查 普通光学显微镜检查 （包涵体）,42,（二）病毒成分检测,1.病毒蛋白抗原检测 免疫标记技术 2.病毒核酸检测 核酸扩增技术 核酸杂交技术 基因芯片技术 基因测序,43,病毒引物,44,45,46,（三）早期抗体检测,可诊断急性感染 特异性IgM抗体：孕妇感染风疹病毒 EA早期抗原抗体（急性感染晚期方可检出） EB病毒 VCA衣壳抗原抗体（IgG急性感染期较早出现， 终身可保持高水平；IgM仅于急性感染期出现 ） EBNA核心抗原抗体 （IgM并非所有病人都有）,47,第二节 病毒感染的特异性预防,微生物及其代谢产物 生物制品 动物免疫血清 （biological products） 免疫细胞 细胞因子 防治和诊断感染性疾病,48,灭活疫苗（inactivated vaccine） 活疫苗（living vaccine） 重组载体疫苗（recombinant carrier vaccine） 亚单位疫苗（subunit vaccine） 化学提取或人工合成疫苗 重组疫苗（recombinant vaccine） 核酸疫苗（nucleic acid vaccine）,一、人工主动免疫常用生物制品,49,二、人工被动免疫常用生物制品,免疫球蛋白 血清丙种球蛋白 （紧急预防） 细胞免疫制剂 （病毒、肿瘤的治疗） IFN-、 细胞因子 IL-2、IL-6、IL-12 TNF 、CSF 淋巴因子激活的杀伤细胞 LAK细胞,50,第三节 病毒感染的治疗,核苷类药物 非核苷类反转录酶抑制剂 蛋白酶抑制剂 其他抗病毒药物 干扰素和干扰素诱生剂 中草药 基因治疗剂 治疗性疫苗,抗病化学制剂,反义寡核苷酸 干扰RNA 核酶（ribozyme）,51,核苷类药物作用机制之一,HSV/VZV 无环鸟苷（NA） 病毒胸苷激酶 NA一磷酸 宿主细胞激酶 NA三磷酸 （缺乏糖环3-OH基） 病毒DNA聚合酶 抑制DNA复制：核酸链 延伸被迫终止,较高亲和力,52,干扰RNA,2006 诺贝尔医学生理学奖 瑞典卡罗林斯卡医学院日宣布，将年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家安德鲁法尔和克雷格梅洛，以表彰他们发现了（核糖核酸）干扰机制。 诺贝尔奖评审委员会发布的公报说，法尔和梅洛获奖是因为他们“发现了控制遗传信息流动的基本机制”，这一机制为控制基因信息提供了基础性的依据。公报指出，干扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治疗疾病的新疗法。干扰机制的发现使得科学家可以对侵入细胞的病毒进行控制。诺贝尔奖评审委员会指出，干扰机制将来有望应用于临床医学和农业等众多领域，用来开发针对病毒感染、心血管疾病和癌症等的新疗法。,53,The Nobel Prize in Physiology or