《AKP活性检测27日》PPT课件.ppt

Q&A 关于噬菌体污染,处理： 1、环境用漂白粉灭菌； 2、用消毒液浸泡相关器具； 3、菌种室甲醛熏消一夜；4、福尔马林溶液浸泡； 5、更换或交替使用发酵剂；6、采用抗性菌株；,特征： 1、培养液变澄清； 2、养份没有被正常消耗； 3、噬菌斑：菌液涂板后出现溶菌透明圈，即噬菌斑；,污染原因：菌体自带噬菌体 (特别是溶源性细菌); 环境中存在；,表达产物AKP蛋白的检测,基因的克隆与表达专题之八,AKP,大肠杆菌碱性磷酸酶 (大肠杆菌碱性磷酸酯酶，EC.3.1.3.1) 在碱性环境下: 水解多种磷酸单酯化合物 需要镁和锰离子为激活剂,关于AKP (E.coli alkaline phosphatase）,AKP的理化性质,蛋白检测指标,1、质,活 性,分子量,定 性,结 构,2、量,表达产率,获得产量,蛋白浓度,纯 度,根据蛋白的特性,Western，测序等,电泳，分子筛，沉降系数等,光/色谱，晶体衍射等,分光， 凯氏定氮等,电泳，沉降、晶体衍射等,1、酶活测定：底物显色法,比尔-朗伯定律：OD = LC pNP=17500L mol-1 cm-1 C:光吸收物质的浓度（molL-1） L:光路长度（cm）,1、酶活测定：底物显色法,注:通过调整稀释倍数控制OD410在0.10.8之间,30反应10min,加入3.6ml终止液终止反应,于410nm处测定吸光值,实验操作,1. 菌体加入15mL匀浆液 2. 超声破碎： 输出功率1200w，超声2秒， 间隔10秒，超声次数：40次 3. 粗匀浆制样： 细胞破碎液 200uL 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL 90变性5min，室温保存准备SDS电泳用。 4. 匀浆上清制备： 另取1.0 mL细胞破碎液，4, 12000rpm10min离心，留上清液 5. 上清液制样： 匀浆上清 200uL 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL ， 90变性5min，室温保存准备SDS电泳用。,一、细胞破碎与制样,二、AKP酶活性分析,谢谢！,自然胶电泳； 变性胶电泳 等电聚焦 梯度胶电泳 印迹转移电泳 双向电泳,2、分子量测定：SDS-PAGE电泳,SDS-PAGE变性胶电泳用途： 亚基分子量的测定，变性蛋白的分离，蛋白纯化中的质量控制等,凝胶电泳的分类：,丙烯酰胺 甲叉丙烯酰胺,TEMED (加速剂),APS (过硫酸铵,催化剂),聚丙烯 酰胺凝胶,T：丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的总浓度 -改变T值改变胶孔径,C：表示交联剂所占百分比,PAGE凝胶电泳原理,SDS-PAGE 的 浓 缩 效 应,电泳体系为不连续体系 电泳缓冲液与凝胶中的缓冲液不同 凝胶也由PH、凝胶孔径均不相同的两层胶组成 电荷效应：Cl的快速泳动在其后面形成低电导、高电压梯度区带动Pr和Gly快速泳动，这样在高电压与低电压区形成界面，Pr浓缩成狭小薄层,Gly 、 Pr 、Cl,分离胶 pH 8.8（12%）,Tris-Gly pH 8.3,Tris-Gly pH 8.3,浓缩后的样品,浓缩胶 pH 6.8（4%）,未浓缩的样品,SDS-PAGE 的 浓 缩 效 应,SDS-PAGE的变性作用,SDS在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键 巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT)的作用使蛋白质分子中的二硫键打开 二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上SDS形成蛋白质SDS复合物 由于SDS带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷 SDS与蛋白质的结合，改变了蛋白质原有的构象，变成了近似于长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比 SDS-PAGE中，SDS蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关-分子筛效应,实验操作,1. 洗净胶板，架好和固定好胶板 2. 配置12%分离胶（20mL） 3. 分离胶混匀后用5mL枪头加入两玻 璃夹缝中，并小心在胶面上加入 1cm蒸馏水，37约2040min后胶自然凝聚 4. 配制4%浓缩胶（10mL），浓缩胶混匀后，迅速倾斜倒出蒸 馏水，将浓缩胶加入两玻璃夹缝 5. 在两玻璃板夹缝中垂直插入1.5mm的梳子，浓缩胶凝固后将凝胶装入电泳槽，在槽中加入1SDS电极缓冲溶液，小心拔出梳子,AKP的SDSPAGE电泳,1). 电泳加样： 将制备好的样品点甩离心后， 按顺序向胶孔中加入适当体积的蛋白样品（20uL-30uL）和分子量Marker（10uL）。 （注意：同时进行顺序和样品完全一致的两组胶的电泳，以备分别进行染色和Western blotting分析） 2). 电泳： 浓缩胶部分电泳条件：80V恒压电泳； 分离胶部分电泳条件：120V恒压电泳。 当溴酚蓝移动到前沿时，切断电源，停止电泳 从电泳槽中取出胶板，小心剥离凝胶，并将凝胶切成两部分。 其中：一部分用R250染色、脱色和观察结果 另一部分准备免疫印迹,6、电泳,1). 染色： 将胶置于20mL的R250染色液中染色2h 3). 脱色： 将胶转移至20mL的脱色液中脱色1.5h，以目的条带清晰显示为准 3). 观察结果： 凝胶成像仪照相并保存结果 4). 胶的保存： 将胶转移至20mL的保存液中，可常温保存很长时间。,7、染色、脱色与保存,谢谢！,印迹(blotting)是70年代中后期出现的一种生化技术 印迹类似于吸墨迹的过程 它常需要和各种凝胶电泳、转移、固定化、分子杂交及许多灵敏的检测技术相匹配而进行 广泛应用于DNA、RNA、蛋白质、抗原、受体糖蛋白等多种生物大分子的研究 电泳 转膜 固定/封闭 抗体结合 检测,3、蛋白定性：Western Blotting,Western Blotting 基本流程,P1:凝胶电泳 P2:转膜(印记） P3:封闭 P4:结合一抗 P5:结合酶标二抗 P6:显色,1）印记方式： 虹吸作用转移 电转移 真空转移 斑点/狭缝印记,2）膜与蛋白结合方式：非共价结合,半干式转移装置,滤纸,P2:转膜(印记）,3）膜的种类：硝酸纤维素膜（NC膜） 尼龙膜,印迹在NC膜上的特异抗原的检出依赖于抗原抗体亲和反应。一般经过封闭、一抗结合、二抗结合、显色等步骤。 一抗对抗原是特异的。酶标二抗是商品化的，对某种动物的一抗都可以反应。 二抗常用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素、生物素、同位素等标记。辣根过氧化物酶的底物有DAB（二氨基联苯氨），OPD(邻苯二氨）等,P4-P6:结合一抗，结合酶标二抗，显色,实验操作,P1:凝胶电泳 P2:转膜(印记） P3:封闭 P4:结合一抗 P5:结合酶标二抗 P6:显色,AKP的Western Blotting,1. 另一部分凝胶、滤纸和硝酸纤维素膜分别在转移缓冲液中浸泡至少30分钟（甲醇的作用） 2. 正极上铺三层和凝胶一样大小的滤纸，然后依次将硝酸纤维素（NC）膜和凝胶铺在滤纸上，再在凝胶上铺三层滤纸，吸干“三明治”样结构周围的印迹缓冲液，并压上负极 （注意不要有气泡） (短路与断路) 3. 恒流1.0mA/cm2转移1.5hr 4. 转移结束后将NC膜取出， 凝胶继续用R250染色以便分析 转移的完全程度 5.NC膜至于5%脱脂奶粉中， 4度封闭一周，待用。,非特异结合,6. 一抗结合：倒去封闭液， 加入一抗（ 1xPBS 按1：100稀释） 370C轻轻摇动，孵育60min 7. 漂洗：1xPBS清洗3次(每次漂洗5min) 8.二抗结合：按 1：1000稀释二抗（偶联辣根过氧化物酶） 370C轻轻摇动，孵育60min 9.漂洗： 1xPBS清洗3次(每次漂洗5min) 10.显色： 用显色液显色至出现清晰条带， 加水冲洗终止显色反应,6. 到去封闭液，加入1xPBS稀释的一抗（稀释的倍数为ELISA所测效价的1/10），加入的一抗工作液覆盖住膜即可。3