妇科白带涂片多功能染色技术简介.ppt

医学染色技术新跨越 妇科白带涂片多功能染色技术简介,株洲康乐检测试剂有限公司,公 司 简 介,株洲康乐检测试剂有限公司是专业生产“妇科白带涂片多功能染色液(BTR)”的厂家，技术力量雄厚，设备先进。第一代CTB染色液，曾荣获株洲市科技进步一等奖，湖南省科技进步二等奖，1997年8月列入国家科技部“九五”科技成果重点推广项目，同年9月列入卫生部第七批“十年百项”推广项目。在各级卫生部门的鼎力支持下，先后在全国举办了100多期推广班。第二代产品妇科白带涂片多功能染色液(BTR)，不但保留了第一代产品的功能，还进一步扩大了检查范围，缩短了检查时间，适用于各级医疗单位、妇幼保健院、计生技术服务站使用，特别适宜于基层及农村应用，尤适于妇科普查。2004年7月第二代产品BTR通过了湖南省食品药品监督管理局组织的专家评审、验收，8月取得了生产许可证、注册证、工商营业执照，并已投入批量生产。 生产许可证号：湘药管械生产许（2004）第0135号 产品注册证号：湘食药管械（准）字2004第2400018号,前 言,妇科白带多功能染色技术，是根据妇科白带病原具有各自不同的形态，采用一种多功能的染色液将其形态染出，再在显微镜下进行识别的一种实用性较强的新的形态学检验技术。也可与多媒体显微镜联合使用，将男女生殖道病原打印成彩图报告，使医生和病人一目了然，而且便于质控。 多功能染色液由R1液（红色）、R2液（蓝色）组成。染白带涂片，能在一张片子上同时作滴虫、霉菌、纤毛菌、淋球菌、细菌性阴道炎（BV）、核异质细胞、癌细胞、老年性阴道炎等多项检查。还可作阴道鳞状细胞分类计数，观测卵巢功能。此外还可作男性尿道分泌物涂片染色；血片染色作白细胞分类计数；胃粘膜切片螺杆菌（HP）染色；痰涂片霉菌染色；胸腹水沉淀涂片和肿块穿刺涂片的良、恶性细胞的染色。方法简便快速，染色形态清楚，适合于城乡各级医疗保健单位和计生服务站使用，尤适于妇科病普查，结果准确，检出率高。,1、取 材：取材部位应根据检查的目的而定。如主要是为了查滴虫、霉菌、细菌性阴道炎（BV）、纤毛菌等，则以采取后穹窿白带或白带较多处标本直接涂片。如临床疑淋病，则应取宫颈管或宫颈内口分泌物涂片，阳性率高，且杂菌少。如宫颈糜烂查癌细胞、核异质细胞，以宫颈刮片较好。如需观察卵巢功能，作阴道鳞状细胞分类计数，则应取阴道侧壁或侧穹窿标本涂片。 2、涂 片：取白带直接涂片，最好涂在玻片的一端即三分之一处较好，不要涂在玻片中间。涂指头大小，厚薄适宜。过厚细胞重叠看不清，太薄阳性率低。作阴道细胞分类的片子，要涂薄些，最好用生理盐水稍加稀释后涂，这样可使细胞分散，有利于分类。如要显示滴虫鞭毛，可先滴几滴1%的葡萄糖水于玻片上，再将白带棉签浸入玻片上之葡萄糖水中涂片，待干后用分步法染色，滴虫鞭毛即可清楚染出。先用高倍镜检查，见到有鞭毛之滴虫，再换油镜查看。,一、取 材 及 涂 片,1、白带染色法：取白带直接涂在玻片上，待干后，滴R1液（红）34滴展开，盖住涂膜染色2030秒倒去染液，水洗，去除片上多余水分滴R2液（蓝）4滴染色：2035秒倒去染液，水冲洗趁湿（稍留一点水，水有透明作用）放显微镜移动夹上面用高倍镜检查如遇肾形双球菌，待片干后，换油镜仔细检视。 2、血片染色法：取已干的血片滴R1液（红）滴展开，盖住涂膜染色1520秒水洗，去除片上多余水分滴R2液（蓝）4滴染色1520秒水冲洗趁湿用高倍镜检查。 注：上述染色方法，供参考，具体操作步骤及染色时间，以产品盒内说明书为准。 染色结果：上皮细胞浆淡红色，细胞核紫红色，细菌、念珠菌蓝色。血片白细胞染色形态与瑞氏、姬氏染色结果相同。,二、染 色 方 法,1、本染液集染色、固定、灭菌于一体，涂片无需另行固定。 2、 胸腹水沉淀和肿块穿刺涂片，红、蓝液染色时间各为2030秒。 3、骨髓有核细胞多，涂片应推薄些，红、蓝染色时间各为2030秒。 4、染色时间，可根据室温高低、病原体着色深浅，灵活掌握。温 度低染色浅时可适当延长染色时间，反之，也可缩短染色时间。 5、如需长期保存的片子，颜色要染深点，以抵消树胶封片后的褪色作用。若要染滴虫鞭毛，红液染色时间应稍加延长。,三、染色时注意事项,鳞 状 上 皮： 阴道及子宫颈外口粘膜均被复鳞状上皮。成年女性阴道上皮分为底、中、表三层。 （一）底层：分为内底层和外底层，均为圆形。 1、内底层细胞是比较原始的细胞，呈圆形，胞体约为中性白细胞的45倍，胞核的直径与胞浆的幅缘相等。核圆形，染紫红色，浆天蓝色。在宫颈严重萎缩或糜烂时，可以见到。 2、外底层细胞：比内底层大，胞浆幅缘大于胞核直径，浆染淡蓝色，核紫红色，呈圆形或椭圆形。 （二）中层：细胞呈船形或梭形，浆丰富，核位于中央。 （三）表层：胞体大而偏平，呈大方块或多边形，有钝角，分两种。 1、网状核（疏松核）表层细胞，即胞体已达表层细胞大小，而核染质仍疏松网状，着浅紫红色，核膜薄有透光感。核：浆=1：510。观察卵巢功能时将之列入中层计数。浆淡红色。 2、固缩核（致密核）表层细胞，胞核固缩变小，色深致密，染黑蓝色，核膜厚，不透光。 在卵巢雌激素的影响下，鳞状上皮由底层发育到表层。其变化的规律是，胞体由小变大，形状由圆形到船、梭形到多边形，胞浆由少到多，胞核由大变小，最后固缩直至消失。,四、女性生殖道正常细胞类型及形态,鳞状上皮发育程序,变化规律是：体积：由小大 形态：由圆船、梭多边 核：由大小消失 浆：由少多丰富 分类计数方法： 阴道磷状上皮细胞，分底层、中层、固缩核（致密核）三种分类计数。凡呈圆形的上皮细胞均分到底层细胞中去；网状核表层细胞按中层细胞计数；固缩核表层细胞单独分类。 方法：涂片染色后，用高倍镜分类计数200个鳞状上皮细胞，分别记录底、中、固三种细胞的数目，除以2，乘以%，即得出其百分数。 例如：某病人分类计数200个鳞状上皮细胞结果为：底层细胞16个，中层细胞160个，固缩核24个，分别除以2，乘以%，则得底层细胞为8%，中层细胞80%，固缩核12%。,例如某妇女26岁，阴道涂片鲮状上皮细胞分类结果： 底层细胞 中层细胞 固缩核,0% 37% 63%,成熟细胞%比高，示雌激素水平高， 右移,又如另一妇女分类结果为： 底层细胞 中层细胞 固缩核,39% 56% 5%,幼稚细胞%比高，示雌激素水平低落（中度）。 左移,1.,2.,五、卵巢功能对阴道上皮细胞的影响,因此阴道细胞的成熟程度与体内雌激素水平成正比。了解卵巢功能状态是诊断妇科内分泌疾病的首要步骤，而检查阴道脱落细胞是一种简单易行反映雌激素水平的定性方法。,阴道上皮细胞的生长发育成熟直接受卵巢内分泌的影响，因此阴道涂片也可以反映卵巢功能。 在正常情况下： 垂体促性腺激素 影响 育龄妇女卵巢卵泡生长发育卵细胞成熟排出 分 泌（主要） 雌激素逐渐增高高峰 影 响 阴道上皮增生变厚致密核细胞增多高峰 排卵后黄体形成 分 泌（主要） 孕激素 雌激素 作 下 用 降 涂片致密核和角化细胞减少黄体末期达高峰,卵巢功能细胞学诊断标准,成熟指数(MI)：是以底、中、表三层细胞所占%比来表示，它反映了各层细胞的动态情况。当卵巢功能低落时，则左侧数字增大，为左移。雌激素水平升高，则右侧数字增大，为右移。如中层数字增大，称居中，表示成熟不全。三层%率相似，称展开，示有超量的雄性激素的影响。 1、 卵泡期MI：0/80/200/60/40 2、 排卵期MI：0/40/600/30/70 3、 黄体期MI：0/60/400/80/20 4、 无排卵型功血：片子特点是缺乏孕激素影响，在雌激素影响下波动着，一般为中高度影响，但也有较长期处于低中度影响的。 5、 有排卵型功血：涂片特点有周期性变化，MI明显右移，呈持续高度影响片型，经前后虽有下降，但仍偏高。 6、 功能性闭经者：如涂片有正常周期性变化，则闭经原因不在卵巢而在子宫。如无周期性变化，出现大量中层和底层细胞，表示卵巢功能中、高度低落，属卵巢性闭经。 卵巢功能低落，以底层细胞计数划分： 1、 轻度低落：底层细胞少，在20%以下，无致密核细胞。 2、 中度低落：底层细胞占20%40%，以中层细胞为主。 3、 高度低落：阴道上皮萎缩、底层细胞占40%以上，外底层细胞为主。 4、 极度低落：阴道上皮萎缩，以内底层细胞为主。 卵巢功能低落，见于产后，哺乳期闭经、绝经后卵巢功能衰退者，双侧卵巢切除后，盆腔放疗后或原发、继发卵巢功能低下。,雌激素影响，涂片内基本无底层细胞，以致密核或角化细胞计数划分： 1、轻度影响：角化细胞或致密核表层细胞占20%以下。见于月经前期，早期卵泡期或小量雌激素治疗。 2、中度影响：角化细胞或致密核表层细胞占20%60%，见于排卵前期，卵泡迅速发育或中等量雌激素治疗。 3、高度影响：致密核及角化细胞占60%90%，正常排卵期或大量雌激素治疗时见到。 4、过高度影响：致密核及角化细胞超过90%，见于体内雌激素过高，或患颗粒细胞瘤，卵泡膜细胞瘤等病人。 正常育龄妇女阴道脱落细胞呈周期性变化，在一定幅度内波动，经前经后多属轻度影响或略高，排卵期往往为中高度影响。,六、单层柱状上皮,分布于子宫颈、宫颈管、子宫内膜以及输卵管内膜。 （一）宫颈的单层柱状上皮（包括腺上皮）可分为两型。 1、纤毛型在细胞的游离缘可见纤毛。 2、分泌型：胞浆内含有粘液，核常被挤压，位于细胞之基底，有时可见空泡，呈柱状或栅状，成群时，可呈蜂房或棋盘状。 （二）子宫内膜的单层柱状上皮，胞体较宫颈柱状上皮小，常呈圆形，胞浆量少，成堆出现时，核常密集，重叠而色深。不要误认为癌细胞。,1、中性及酸性白细胞、红细胞（在月经期或宫颈糜烂刮片时可以见到）、淋巴细胞、浆细胞。 2、组织细胞： 小组织细胞：约中性白细胞到外底层细胞大小，呈圆或卵圆形，核圆或卵圆，多偏于一侧。浆内可有吞噬的异物。 巨型组织细胞（多核组织细胞）：胞体巨大核可由数个数十个。 3、精子：染紫红色，两端钝圆，头部有不染色区，带有尾巴。在脱掉尾巴时，不要误认为霉菌孢子。霉菌孢子染蓝色，一头尖，呈矛头或芝麻状。,七、阴道涂片中的非上皮成份,1、滴虫：多为梨形、圆形、椭圆形或不规则形态，浆丰富，染灰蓝或天蓝色，边缘色深，浆中可有少数红色小颗粒。核小，梭形，枣核状，染紫红色，常偏于一侧，偶尔可见鞭毛。 2、念珠菌（霉菌）：孢子矛头状，染深蓝色，可见芽生孢子，假菌丝细长而直，有分枝及分隔，染蓝色。着色不匀。,八、白带涂片中的病原成份染色形态,图 例： （400）,图 例： （400）,1：各种形态的滴虫 2：上皮细胞 3：白细胞,1：念珠菌丝 2：孢子 3：上皮细胞 4：白细胞,3、纤毛菌：细长如发丝，染蓝色，有弯曲，可与滴虫并存。但须注意与涂片中的粘液丝相区别，粘液丝粗细不匀，染紫红色。 4、淋球菌：染黑蓝色，呈典型的肾形相对双球菌，多成团出现于中性白细胞、组织细胞内外。以肾形相对双球菌，分中性白细胞内外发报告。不要直接报淋球菌。,图 例： （400）,图 例： （400）,附注： 淋球菌属于奈瑟氏菌属，该菌属有十种细菌，其中：有致病性的有2种（脑膜炎双球菌，淋球菌）。 无致病性的有8种，均为肾形相对双球菌，直接涂片以在中性白细胞内见到肾形双球菌，作为有致病性的标志。,淋球菌的细胞壁，由粘肽层和外膜构成。外膜由脂多糖（内毒素），外膜蛋白、和菌毛等组成。淋菌借助菌毛、蛋白和它释放的IgA分解酶的作用，粘附于柱状上皮、移行上皮上，其蛋白即迅速转移入细胞膜内，引起膜反应，而被吞饮入上皮细胞内，大量繁殖，导致细胞损伤崩裂，再逸出至粘膜下层。其内毒素与补体、IgM等的协同作用引起炎症反应，白细胞浸润。 淋球菌的内毒素存在于外膜的表面，中性白细胞将其吞饮后，想利用胞浆内的溶菌酶将之杀灭，故在中性白细胞内见的肾形双球菌，是有致病性的，很可能是淋球菌；而在细胞外见到的只能说有奈瑟氏菌，应建议培养鉴定。,5、细菌性阴道炎（BV）加特纳氏菌呈球杆状，染灰紫色，低高倍镜下呈细砂状，并可见线索细胞（胞浆中布满球杆菌的上皮细胞或中性白细胞叫线索细胞）。镜下诊断BV之条件为：、涂片中的球杆菌应（+）。、有线索细胞。、如涂片中的球杆菌数量较少时，线索细胞应20%。 6、阴道杆菌粗长，染深蓝色，其它细菌染灰蓝蓝色。,图 例： （400）,图 例： （400）,7、老年性阴道炎，是由于卵巢功能衰退，雌激素水平高度或极度低落所致，涂片中出现大量底层细胞，以内底层细胞为主，部分内底层细胞核有固缩改变，如伴有继发感染，还可见较多之白细胞。应结合年龄及临床症状诊断之。,图 例： （400）,核异质细胞是介于“良”、“恶”性之间的细胞，可视为由量变到质变的过渡阶段，其主要改变在核。可来自鳞状上皮或宫颈内膜上皮。可分为： 1、底层核异质细胞：圆或椭圆形，核增大染色质增多，着色略深，核形可不规则，可见双核，胞浆天蓝色较丰富，一般幅缘不小于核之直径。 2、中、表层核异质细胞：主要改变为核增大，核形不整齐，可出现双核、多核，染色质加多，色深，浆丰富，可见核周空泡。 3、宫内膜核异质细胞：少见，多为柱状，偏心核、核大深蓝。胞浆常因含粘液而着色不匀或有空泡。 核异质细胞主要见于非典型性增生、原位癌及浸润癌的涂片，炎症涂片、女性妊娠涂片也出现，但一般改变较轻，数目少。如发现有较多重度核异质细胞时，特别是底层核异质细胞和宫内膜核异质细胞，应注意找癌细胞。,九、核异质细胞及其染色形态,十、癌细胞的快速染色形态,来自上皮的恶性肿瘤统称癌，来自间叶组织的恶性肿瘤统称肉瘤。阴道、宫颈鳞状上皮发生的恶性肿瘤为鳞癌，占宫颈癌的95%。由宫颈内膜柱状上皮发生的为腺癌。癌组织脆、癌细胞容易脱落，故直接涂片是一种早期发现宫颈癌的简便方法，对宫颈有糜烂的患者每年至少检查一次，对重度宫颈糜烂的患者最好半年检查一次。 癌细胞的特征： 1、形状及大小：癌细胞可为圆形、卵圆形或不定形状。90%癌细胞较正常细胞大、甚至于有比表层细胞还大的巨型癌细胞。小型癌细胞仅大于中性白细胞，比内底层细胞还小。 2、胞浆量少，着天蓝色，也可着粉红色，变性时浆内可见空泡，有时胞浆溶解仅剩下裸核。 3、核：a.核增大，核浆比例失调，核直径大于胞浆幅缘。b.核深染，粗粒状或致密块状，其间可见透明区。c.核形：圆、卵圆或不规则，边沿不整齐，为碎石子状、哑铃状等，核上可见空泡或核仁。 癌细胞的特征可概括为：核大、色深、质粗、浆少，核形不规则，边缘不整齐，大小不等，7句话22个字。,鳞癌细胞的形态： (1)圆形癌细胞来自底层细胞，核大色深，直径大于胞浆幅缘，染天蓝色。 (2)纤维状癌细胞：胞体及胞核均细长，为纤维状，核多在细胞的中段，深染。 (3)蝌蚪状癌细胞，头大尾细，形如蝌蚪，核在头部，可为单核、双核或多核。 (4)除上述细胞外，鳞癌细胞还可有多种多样其它形态，应注意识别。 腺癌细胞常成群出现，细胞边界不清，浆灰蓝色，可出现空泡，核被推向一边。核圆或卵圆，大小差别较大，染色质增多，分布不匀，核仁大，具有一般癌细胞的特征。 结果报告：细胞学可分三级报告。级正常，级为有核异质细胞或可疑细胞，级为有癌细胞。但核异质可分轻、重二度和数量多寡，故、 级还是以直接写明报告为好，一般只用级报告。,图 例：,印章式报告法,检 验 物：白带、宫颈刮片、颈管片（请划） 检验目的：多项或BTR特染,十一、妇科白带涂片染色检查结果举例,湖南省妇幼保健院妇科白带涂片多功能染色临床试验结果 2004年3月5日,表1： 206例白带标本不同方法对照检查结果,多功能染色法多检出滴虫、霉菌9例，阳性率高4.3%。P0.1，无统计学差异。,4.37,9,6,3,相差,155,24.75,51,27（13.10）,24（11.65）,盐水法+KOH法,146,29.12,60,33（16.02）,27（13.10）,BTR染色法,阴性,阳性率%,小计,霉菌,滴 虫,名 称,三种染色结果一致,表3： 36例血片两种染色白细胞分类累计结果,两法结果基本无差异，瑞氏染色需56分钟，多功能3040秒。,表2： 42例白带涂片三种染色对照检查结果,表4： 南 通 医 学 院 11280 例 标 本 CTB 染 色 检 查 结 果,摘自南通医学院附属医院CTB染色技术常见误差分析 2000年11月18日,表5： 715 例 妇 科 白 带 涂 片 染 色 检 查 结 果,（注）：条件致病菌（+）以上方统计 地点：安仁县平安镇 时间：2002年8月2003年4月（2月停作一个月） 标本来源：安仁县二人民医院妇科门诊病人,表6： 96 例 二 重 感 染 结 果 表,经统计学处理：X2 7.51，P0.01 差异显著。,表7： 154 例 BTR 染 色 与 盐 水 涂 片 对 照 结 果,十二、 讨 论,1、本法作妇科白带涂片染色检查。一张涂片能同时作多项检查，方法简单，结果准确，检出率高。检查时间只需几分钟，即可报告结果，十分方便病人。已固定的涂片，放10来天不影响染色结果。片子用中性树胶盖片封固，可长期保存，作教学用。 2、阴道搔痒病人，涂片背景以上皮细胞为主者，注意在上皮分布处寻找霉菌。但玻片应清洁无生霉，以免引起假阳性。而本染色念珠菌丝呈蓝色，玻片长霉时的曲霉菌丝为紫红色，可以分辨。 3、涂片有大量白细胞时，注意找淋球菌。中性白细胞内查到肾形双球菌，说明该菌有致病性，可能是淋球菌。如只在细胞外见到，只能说查到奈瑟氏菌属的细菌，应建议培养 4、对涂片中之条件致病菌（非阴道杆菌），可根据细菌数量，如大量、较多、部分，再结合形态、排列方式，如小杆菌、球菌等，描述报告。也可将之列入杂菌以“+”报告之。一般杂菌（+），可不报告，杂菌（+）时方发报告。 5、本法检查滴虫不受温度影响，滴虫在2542下可活动。盐水涂片查滴虫，冬春二季天气冷，滴虫活动受影响，阳性率低。霉菌喜依附于上皮上生长，而上皮细胞在盐水中透明度差，有遮盖，数量少时难以检出，阳性率低，本法则无此弊。 6、涂片中阴道杆菌缺乏或未见细菌，也应报告供参考。 7、衣原体为严格的细胞内寄生物，分为始体和原体两种，原体进入细胞后，即发育成始体，再以二分裂方式增殖成原体，原体在细胞浆内堆积，可形成包涵体。因此在宫颈刮片的上皮细胞胞浆中，如见到有染成灰蓝色小米粒大小的原形颗粒，13粒时，要高度考虑衣原体包涵体，应建议作衣原体检查。,十三、胃粘膜切片螺杆菌快速染色法,1、染液配制：取妇科涂片多功能染色R2液（蓝）10ml，加95%酒精40ml稀释，即为螺杆菌（HP）染色液。 2、染色方法： （1）单染法：切片按常规脱蜡水洗，甩去片上多余的水份，滴加上述HP染液于片上，染色约1分钟，水洗，等干后封片镜检。先用高倍镜观察，如遇可疑HP时再换油镜仔细检视之。 （2）与HE合并染法：将胃粘膜活检标本多切12片，贴于玻片的一端，按常规先行HE染色，待片子干后，选贴在玻片最外端的一片，滴滴HP染液于其上，染色约30秒，水洗，干后封片镜检。 3、结果：HP染蓝色，呈S形、螺旋形、弧形等，多分布于粘膜浅层的胃小凹