电刺激与电记录方法学

电刺激与电记录方法学,电生理学方法(Methodology of Electrical Stimulation),起源：1791年，电流计的发明,发展：20世纪20年代，电子管放大器、阴极射线 示波器 40年代，微电极技术 60年代，电压钳技术 70年代末，膜片钳技术,神经科学的发展与电生理学技术的进步密切相关,电生理,与神经科学有关的诺贝尔奖项,电生理学实验室布置示意图,刺激器的演变,锌铜弓,感应线圈刺激器,晶体管刺激器,集成电路刺激器,计算机模拟刺激器,电刺激方法学,A,B,C,“阳台实验”,A,B,C,利用电刺激方法得出：,可兴奋组织的时间强度曲线有髓纤维的节间长度神经纤维的传导速度可兴奋组织的不应期神经肌肉接头传递障碍的诊断外科手术中神经分支的判断脑部核团的判断疼痛与癫痫的控制PD的治疗（细胞刀）.,1.电刺激的特性2.神经组织制备的特性3.选择性电刺激方法4.刺激电流扩散的控制,主要内容：,1. 性质易于描述2. 施行方便，可精确控制3. 刺激是可逆的，短时间内可重复给予,电刺激的种类,方波、直流电、锯齿波、三角波、正弦波,电刺激是适宜的人工刺激,一、电刺激的特性电刺激：强度 时间 频率,1.强度 阈强度：能引起可兴奋组织兴奋的最小刺激强度。 相当阈此种强度的刺激为阈刺激； 能恰使膜去极化达到阈限的电流为阈电流。,2.时间 刺激要求一定的作用时间，即刺激脉冲的波宽。 强度与波宽的关系：时间强度曲线,时值： 保持强度时间变化率不变的情况下，两倍于基强 度的刺激引起组织反应的最短刺激时间。,时值小：兴奋性高时值大：兴奋性低,3.频率,绝对强度尺度：电刺激类型、输出阻抗、强度、时间、频率 电极与组织的相对位置、电极的形状与物理 特性、神经组织的成分,生物校准尺度：用刺激引起的生物效应作为刺激强度的相对尺度。 以刚出现的电反应为1T，更强的刺激以1T的倍 数表示。优点：以生物效应将刺激强度标准化， 且易于监测。,例： 外周神经干 AP 中 A 纤维成分出现为 1T A 纤维成分出现为 2T A 纤维成分出现为 5T C 纤维成分出现为 20T,神经电刺激的极性法则,1. 通电时的阴极兴奋作用,当与直流电源相连的电极与神经组织接触时，电流的移动方向是：,A:电流从正极通过膜外溶液流至负极B:电流从正极流向膜内，通过胞浆流向负极，再经膜 内流出至膜外负极,正极： 内向电流负极： 外向电流,阳极： 内向电流在具有电阻与电容性质的膜上造成的电压降 与膜原有的极化状态（内负外正）一致，使膜超极化；,阴极： 外向电流造成膜两侧出现内正外负的电压降，与膜原有 的极化状态方向相反，使膜 去极化，达到阈电位水平 产生 动作电位。,2.断电时的阳极刺激作用 电流接通时兴奋发生在阴极，同时阳极部位加重了极化 状态，电荷过剩。,阳极：电流断开时，过剩的电荷消失，膜的状态由通电时的 超极化回到静息状态，这种局部极化状态的消退相当 于去极化。,阴极：断电时阴极部位的去极化减弱，兴奋性有所降低， 称为阴极后阻抑。,通电时兴奋发生在阴极部位，断电时兴奋发生在阳极部位。通常情况下：通电刺激效应 断电刺激效应,刺激伪迹,刺激电流（电压）通常比生物电反应大，刺激脉冲可被记录电极拾取，记录系统形成伪迹。,伪迹的成分：,电容成分,电阻成分,刺激伪迹与刺激强度成正比，过小：不能起标记作用 过大：覆盖生物信号,减小刺激伪迹方法：1）增大刺激电极与记录电极之间距离2）在刺激与记录电极之间连接地线3）应用隔离器，且隔离器尽可能靠近被刺激生物体,刺激电极电极材料：1）良性导体；2）毒性小： 3）价格便宜电极种类1）单极电极：尖端面积小，可产生足够密度的电流 作用电极为一根金属丝，尖端较细，接电源阴极，无关 电极面积较大,接电源阳极。 缺点：刺激伪迹较大2）双极电极：两个并列、间隔1mm或更小但不短路的白金 丝或不锈钢丝。,R,S ?,问题：应用双极刺激电极时, 电极的极性应如何放置？,急性实验用电极,导电性能是首要标准. 仍需注意插入神经组织的电极可引起神经元坏死、毛细血管破裂、组织水肿等不良反应。,慢性埋藏电极,在神经组织中埋藏刺激或记录电极，便于在动物正常清醒情况下，给予刺激或记录神经元电反应。,金属材料对神经组织的毒性是首要标准。长期埋置电极可造成：局部胶质细胞增生、神经元核仁位置改变等结构变化。,白金 不锈钢 钨 银 铜,二、神经组织制备的特性,1.可兴奋组织的电导与其含水量有关。 肌肉组织含水量：75 脑组织含水量：68电导的不均匀性提示：强电流刺激可使电流流向非预期刺激的结构。故中枢宜采用微刺激。,软膜组织电阻：50-100/cm2 特点：软膜组织暴露在空气中后，电阻与电容性质 改变，实验中可不再考虑,近脑室和脑脊液电阻：灰质电阻=1:6软脊膜的脑脊液具有较大的电流效应,2.神经纤维的直径,细胞外刺激条件下 直径粗的轴突：施加弱电流即可兴奋 直径细的轴突：施加强电流才可兴奋,3.神经元的不应期,条件检验刺激方法（两刺激参数相同）,通常，神经纤维越粗，传导速度越快，不应期越短。 外周粗纤维不应期：1ms 中枢A-C纤维不应期：0.6-2.0ms,不应期的测定,4.同步放电,电刺激神经组织可产生以下结果：（1）模拟一个系统的正常机能活动（2）中断一个系统的正常机能活动（3）产生与正常机能无关的活动电刺激脑：许多神经元出现同步放电。其结果使神经递质释放增多并在细胞间隙堆积，或胞外某些物质被神经元摄取而枯竭。,5.激发,重复电刺激脑部（数秒/日,连续数日），如杏仁核、尾核、海马等，可出现被称为“激发”的现象： （1）阈值降低 （2）痉挛,癫痫发作（点燃模型）,有时重复电刺激出现“负激发”：受刺激脑部兴奋性降低,6.延迟效应,大部分脑组织对电刺激的反应是立即出现， 电刺激运动皮层：1-2S后即出现反应部分脑区的刺激效应需经数小时或时日才出现 电刺激猫外测下丘脑：1h内无任何反应， 24h后进食量增加600。,7.可疲劳性,电刺激后脑结构可出现疲劳,先后顺序为：（1）数秒内迅速疲劳，如运动皮层（2）数分钟内缓慢疲劳，如尾核与壳核（3）不疲劳，如刺激外侧下丘脑可引起无限期 瞳孔收缩.,8.变异性,三.选择性刺激,1.分级强度刺激弱刺激：兴奋类纤维，以A出现为1T 刺激强度 ( T ) 兴奋的纤维 1.3 - 2.0 类（ A） 2.0 - 2.5 类（ A）达最大值 5.0 类（A） 达最大值 5.0以上 类开始兴奋,弱刺激：兴奋类纤维，以A出现为1T 3.0 6.0 A 10.0 所有的有髓纤维 15.0-20.0 C,选择性兴奋粗纤维,局麻药（可优先阻断细纤维） 分级强度刺激,选择性兴奋细纤维,粗纤维对压迫、缺血、缺氧、冷冻或某些药物敏感，用上述方法将粗纤维阻断后 分级强度刺激,分级强度刺激法缺点：随着刺激强度的增加，阈值较高的纤维兴奋的同时，可使全部粗纤维兴奋。故该法只能选择性兴奋较粗的有髓纤维,2.双排放刺激（条件检验刺激）,原理：利用轴突的不应期,刺激特定的细纤维,方法1.条件刺激强度：达到使全部粗纤维都兴奋的程度2.检验刺激强度：除兴奋全部粗纤维外，还应兴奋 一种以上细纤维 (A,C)3.调节2个脉冲间隔并逐渐缩短,使检验刺激出现在 条件刺激引起的全部粗纤维兴奋的不应期内,此时 原来由检验刺激兴奋的粗纤维均不出现反应,只剩 下原有检验刺激兴奋的粗纤维成分 选择性兴 奋细纤维.,3.顺向刺激与逆向刺激（Anti-stimulation and ortho-stimulation）,顺向刺激与记录,S顺,R,逆向刺激与记录,R,S逆,逆向反应的特点:1.相对恒定的潜伏期;2.可跟随高频电刺激;3.碰撞实验是检验逆向 反应的标准.,问题:如传导距离相等,纤维类别相同,顺向反应与逆 向反应的潜伏期是否有差别?,碰撞实验,S1,S2,R,如果S1与S2不同时到达记录点,可分别记录出顺向反应与逆向反应. 调节S1与S2间隔,使顺向刺激与逆向刺激引起的反应在同一记录部位相撞时,反应消失.,用途:研究CNS内两点间的机能联系特点:1.研究神经元之间联系的同时观察其电生理学特性 2.研究刺激部位与记录部位之间的机能联系 3.简便易行,碰撞实验,4. 跟随不能,粗纤维可跟随高达 50Hz 频率的刺激(刺激反应一一对应),50Hz 刺激可阻滞传导速度较慢的A类纤维(A),10-20Hz时 C纤维被阻滞.,高频刺激可选择性地兴奋粗纤维.,实验,5.阳极阻滞,阳极下可兴奋组织地静息电位远离阈电位,不易引起动作电位,使神经冲动受阻. 阳极下的粗纤维更容易超极化.,阳极下粗纤维首先受到阻滞.,方法,在可控制直流电作用下,随着电流强度的增加,受阻滞的神经纤维按照以下顺序先后受阻:,50 - 500AA A A ,不足:1)神经纤维有快速损伤的危险(直流电热效应与 电解效应) 2)断电时出现阳极兴奋,改进:1)选用阴极,阳极位置倒换的短脉冲电流 2)选用前沿陡,后沿呈指数下降的三角波 3)选用三级电极(两端为阳极,中间为阴极),6.脊髓索局限刺激,传统方法:在预备刺激的脊髓索上放置刺激电极,同时将 与其相邻的索在刺激电极的尾侧端给予横断, 使兴奋不能沿无关的索或束下行.,头端,尾端,DLF DC DLF, ,刺激电极,横切,缺点:仍有电流扩散,解决方法:,1)控制刺激电流强度2)使用同心圆电极3)应用单极刺激4)应用隔离制备方法 A:横切制备 B:用塑料薄膜或云母片将DC与DLF隔离,7.定位微刺激,在脊髓,中枢脑部经立体定位,可用微刺激兴奋或损毁局部神经组织.,刺激电极: 10 - 15m金属微电极(电极干绝缘) 玻璃微电极(内含钨丝,尖端裸露),刺激: 弱电流(100 A) 单脉冲:可直接兴奋神经元 串脉冲:可直接兴奋神经元,也可经突触兴奋 神经元.,8.细胞外,内刺激,方法: 应用多管微电极 多管微电极,给予电流刺激记录电反应平衡或给药,注意事项: 1) 被刺激细胞体积应足够大 2) 电极尖端较粗,易损伤细胞,9.,四.刺激电流的扩散,1.有效兴奋点,1939年:分级强度刺激时,AP潜伏期随刺激强度增加而缩短;1944年:分离坐骨神经标本(5根纤维)发现 1.2T刺激 为15.0m纤维出现AP (1) 2.0T刺激 为9.5m纤维出现AP (2) 3.0T刺激 为8.0m纤维出现AP (1) 10.0T刺激 为4.0m纤维出现AP (1),问题:上述逐次被兴奋的纤维,特别是粗纤维AP的潜伏期随着 细纤维AP的出现而向前移动,即随着刺激强度增大,粗 纤维AP潜伏期缩短.,疑问: 传导速度与纤维直径成正比例的变化.,原因: 刺激强度增大 电流向更远距离扩散 刺激的 有效兴奋点由原来的阴极下逐渐向纪录电极处移动 刺激电极与记录电极之间距离缩短 潜伏期变短,V=,S,T,2.跨索刺激效应,3.潜伏期跳跃,1979:Mayer记录下丘脑腹内侧核对刺激中脑中央灰质 引起的逆向反应中发现.随着刺激强度增大,逆向 反应的潜伏期可缩短或向前跳跃,最大可达9.8ms.,将此种发生在神经元上AP潜伏期缩短的现象称为“潜伏期跳跃”.,原因: 1)电流扩散使刺激电极与记录电极间距离缩短; 2)刺激部位神经元轴突侧支有不同的阈值.,在大鼠在体制备上发现,刺激强度增加时,不仅出现潜伏期缩短,还可出现2-7个附加的锋电位.,原因: 1)电流扩散 刺激点与记录点距离缩短; 2)电流扩散并兴奋其他传入纤维 引起附加 AP,在 CNS 中发现,给予重复电刺激(1-20Hz),还可出现潜 伏期逐渐延长的现象,称“潜伏期漂移”(latency drifting).,原因: 可能与兴奋后抑制的逐渐积累有关.,4.有效电流扩散,应用单极刺激电极: 有效刺激距离与阈电流强度之间关系为,CNS内有髓纤维与刺激电极距离越远,阈值越高;统一距离情况下,纤维传导速度越快,阈值越低.,刺激电流有效扩散半径与电极种类和电极尖端大小有关,单极电极:有效扩散半径最大双极电极:有效扩散半径次之同心圆电极:有效扩散半径最小,10m的单极刺激电极: 10 A短脉冲,扩散范围为150 m内有髓纤维 100 A短脉冲,扩散范围为500m内有髓纤维,5.刺激电流与扩散距离关系,刺激电极位于神经组织深部,其尖端完全被神经组织 包裹,刺激电流以辐射形式向所有方向以球形扩散;,刺激电极位于神经组织表面,刺激电流以半球状对称 流动,最容易兴奋的部位是有髓纤维朗飞氏结,0.1A即可 将其兴奋,故刺激电流扩散取决于电极与朗飞氏结的 距离,小 结,电刺激技术是发展中技术;电刺激方法存在局限性;电刺激是一个单调的非特异刺激,只能刺激 已有的机能,却无法创造新的机能;4. 应正确使用电刺激技术,避免滥用.,神经系统活动的最基本或唯一的直接表现形式,电变化,50年代： 微电极技术,细胞水平,70年代：,膜片钳技术,分子水平,电记录方法学（Methodology of Electrical Recording),生物体,S,R,放大器,生物放大器微电极放大器膜片钳放大器,示波器记录仪计算机,显示和记录装置,电生理记录方法： 粗电极记录：整体水平 微电极记录：细胞、通道水平 在体记录： 整体水平、细胞、通道水平 离体记录：,电记录技术,一.器官或整体水平的电记录方法1. 容积导体记录,生物体可兴奋细胞,周围组织间液：,具有长、宽、厚三维空间容积导体。,如果没有电流在容积导体内流动，容积导体各处的电位是相等的。,只有当可兴奋细胞传导冲动时才有电流在细胞间 流动。活动区与不活动区之间才会出现电位差。,由于细胞间液里含有导电性能的电解质，所以脑内某些神经元活动产生的电流变化，往往影响整个中枢神经系统所发生的电变化，即在整个容积导体的范围内可以引导到电反应。,脑电波记录部位在头皮，电位发生在颅内。,容积导体,许多在体的电生理记录方法已成为独立的临床诊断手段，如心电图、脑电图、肌电图等。,通过容积导体的电记录,单极引导：,R1,电场,+,-,R2,远离电场，即容积导体内相对不活跃的部位，活动组织产生的电场影响之外的部位无关电极或参考电极，该处的电位相当于零电位。,置组织活动时产生的电场中测试电极,单极引导：,测试电极近电源处,正电位,测试电极近电汇处,负电位,测试电极距离电源或电汇越近，电位数值越大；测试电极距离电源或电汇越远，电位数值越小。,真正的正电位与负电位只能用单极引导才能得到。,双极引导：,两个记录电极均放在组织活动时所产生的电场当中,所测得的电位表示两电极之间的电位差，两个电极的相对位置越近，电位差越小。,电场,1.肌电图（Electromyogram,EMG）,在活体内，当肌肉收缩时，动作电位可从肌纤维经组织的导电作用反映至皮肤表面。在皮肤表面放两个金属电极或将针电极直接刺入肌肉内，可记录到肌肉活动时的动作电位。这种记录称作肌电图。,测定整个 运动系统 功能的一种手段,上运动神经元（皮质）,下运动神经元（前角细胞和神经轴索）,神经肌肉接头,肌肉,EMG电极：,1）针型电极（常用）2）表面电极,EMG测定一般分4个观察步骤：1）插入电位2）静息期3）MUP4）募集电位,1）插入电位 当针电极插入正常肌肉时，在大部分情况下，只在针电极插入或移动瞬间出现一些持续时间很短的电位变化，称为插入电位。针电极移动一停止，插入电位即消逝。这是针电极对肌纤维或神经分支的机械刺激及损伤作用所引发的电位。,当发现插入电位活动明显减少或缺无的插入电位时,提示肌纤维数量减少（严重肌萎缩或肌纤维化）,*这时先排除技术性原因：导线破裂、插入不够深使针停留在皮下脂肪内等 。,当发现插入电位延长,提示肌肉的易激惹或肌膜的不稳定（失神经状态、肌强直、肌炎）,2）静息期,观察肌肉在不收缩时（完全放松）是否有异常活动。,当神经、肌肉有疾患时，在肌肉放松时，会出现异常的电位发放。自发性电位包括纤颤电位、正锐波、束颤电位、肌蠕颤放电及复合性重复放电。最常见的为纤颤电位、束颤电位。,1、纤颤电位： 肌纤维自发性收缩产生的电位（电压300v,持续时间大多20ms, 频率2-10次/秒）。,下运动神经元病变所致,脊髓前角细胞及周围神经发生病变时，肌肉失去神经支配出现肌肉纤维颤动时产生的电位。,2、束颤电位：,束颤电位是在肌肉放松时产生的运动单位自发发 放电位。是由同一神经元所支配的全部或部分肌纤维 兴奋产生的电位。 波幅：2-10mv; 持续时间可达 2-30ms ; 发放频率：几分钟一次至每秒数十次。,束颤电位本身不能确定为异常，只有同时发现纤颤电位等才有肯定的病理意义。是运动神经元病（如脊髓前角灰质炎）和神经根疾患的主要表现。,MU是随意收缩最小的功能单位。神经和肌肉发生病变时会影响到肌肉的结构和功能， MUP可反映其变化。,4）募集电位,大力收缩时引出。 参加收缩的运动单位数量和发放频率有所增加，有些区域电位密集不能分离出单个电位， 有些区域仍可见单个运动单位，称混合相（图B）。,最大力收缩时，无法分辨出单个运动单位电位电压 显著升高，不同振幅与频率的运动单位的电位参差重叠， 称干扰相（图A）。,脑电图（EEG）：,人类或脊椎动物在安静情况下，即使没有任何特定的刺激，在脑表面也能记录到持续节律性的电位变化，这种电位变化称为脑的自发电活动或脑电图。,正常人大脑发放的基本节律：,根据脑电波的频率、波幅、波型、发作性发放及位相关系确定是否异常。,脑电图的常规记录方法：,单极引导（monopolar lead）：,一个引导电极与一个参考电极（通常放在一侧耳垂上）之间的电位差。,双极引导（Bipolar lead）：,引导一对电极间的电位变化。,把引导电极直接放在大脑皮层表面记录其自发和诱发电活动，所得图形称皮层电图（ECoG). 一般直接从皮层记录的电位要比从头皮记录的电位大10倍。,EEG对异常脑活动敏感但不特异 脑部的弥漫或局限损害; 癫痫、脑炎、肿瘤及脑血管疾病诊断.,50%以上的癫痫患者，在发作间期有异常脑电活动，出现棘波、尖波、棘-慢复合波或爆发性节律等病理波。,部分癫痫患者，在发作的间歇期脑电图上不出现 痫性放电，可用过度换气、闪光刺激、睡眠等诱发方 法，使潜在的异常波呈现，即诱发试验。,（二）诱发电位记录,诱发电位记录技术,1913年:,感觉机能的中枢定位;神经元之间连接及投射关系.,计算机应用:平均诱发电位技术(临床应用),诱发电位亦称为场电位，它不是单细胞放电，而 主要由许多突触后电位总和而成。,诱发电位是与自发电位相对而言，常常出现在自发电位的背景上。应用计算机可以把在发生时间上不规则的自发脑电经过叠加相互抵消为一条平坦的线，而把有一定潜伏期的诱发电位突出出来。,诱发电位的鉴别：,1）潜伏期：,诱发电位的出现与给予刺激之间有一定的时间关系，即诱发电位必有一定的潜伏期。,2）反应型式：,不同感觉系统的反应型式可以不同。例如听觉的皮层诱发电位, 视觉的皮层诱发电位。,同一系统中反应型式相同。如在听系统，刺激蜗神经或刺激斜方体在皮层记录到的诱发电位都是相同的。,3）空间分布：,诱发电位在脑内有一定的分布，即刺激外周某一部位，诱发电位只限于中枢神经系统的一定部位（指主反应）点对点传导。,4）与伪迹的关系,刺激伪迹对测定诱发电位的潜伏期起到标记的作用。但伪迹过大可掩盖诱发电位，甚至在没有诱发电位的情况下，将伪迹误认为诱发电位。 简单的鉴别方法：将刺激电流的极性倒转，因伪迹是一种物理现象，它必定会因极性倒转而倒转；而诱发电位是由电流刺激所引起的生理反应，它不会因刺激电流极性的改变而改变。,（一）视觉诱发电位 （Visual Evoked Potential,VEP ）,经视网膜给予视觉刺激时，在两侧后头部（枕叶皮层）记录到的电位变化。,（二）听觉诱发电位 （auditory evoked potential,AEP or auditory brainstem response,ABR）,短声刺激时在头皮上记录到的听觉诱发电位。,听觉诱发电位（AEP）：,早成分(前50ms）,前10ms内几个波形（远场电位或脑干电位） 听神经、脑干电活动。,其后12ms-50ms的波形（中潜伏期电位）：丘脑非特异核团、内侧膝状体、听皮质电活动。,按潜伏期长短分为:,晚成分（100ms以后）： 反映大脑皮层投射区活动的电位。 N100负波: 波幅高，易于识别. 临床上可作为测定听阈及诊断疾病的指标。,但“晚成分” 易受觉醒和注意力的影响。,记录方法:引导多采用单极引导法，引导电极置于10/20法的头顶Cz部位，参考电极置于乳突部相当于A1部位。也可采用C3-A2，C4-A2。,（三）体感诱发电位 （somatosensory evoked potential,SEP）,给予皮肤感受野或外周神经刺激，在刺激的对侧大脑皮层躯体感觉区记录到的大脑皮层电活动。,家兔大脑皮层体感诱发电位,（四）髓背诱发电位,刺激外周神经躯体感觉传人神经时，在脊髓背表面记录到的电位变化。该电位由一个峰电位，一个高幅负相电位和一个低幅、长持续期的正电位所组成。,峰电位:是脊髓内传导速度最快的初级传人纤维 的动作电位；慢的负向电位:代表背角中间神经元的活动，紧随负向电位之后的正向电位是初级传人末梢去极化在脊髓背表面的一种反映。,脊髓背表面电位在全身麻醉无法观察体征时，可一定程度上反映的脊髓功能情况，麻醉对其几乎无任何影响。,二. 细胞水平的电记录方法,细胞内记录,细胞外记录,（一）细胞外记录,通常在细胞外记录得到一个短暂的双相峰波（正-负）。有时可能记录到单相的正峰电位，甚至可记录到三相电位（正-负-正）。,在细胞外得到的电位比细胞内记录小很多，因为信号被低电阻的细胞外通路分流所致。一般为0.1-20mv变化, 5 % 。,细胞外记录,判断一个动作电位是属于一个或几个神经元的标准： 动作电位的形状和振幅。,鉴别方法：,放电在形状和振幅是相同的,在不同程度或不同组织刺激下发生全或无的变化,在刺激作用下有一定的潜伏期和特有的发放次序,放电属于同一神经元,锋电位的形状和极性取决于,锋电位的时程: 1.0-1.5ms 与胞体的兴奋有关；,0.5ms 与轴突的兴奋有关；,15-20ms 与树突的兴奋有关。,（二）细胞内记录,细胞内记录: 可获得细胞在静息期与活动期有关膜电 位变化的定量的资料。,膜电位 突触电位 动作电位,细胞内记录,细胞内记录要求:,1）稳定性：,两方面,机械运动（如实验台）,动物体运动（如呼吸）,微电极和所插入的细胞之间的相对位移不能超过几个m，才能持久地记录细胞内电位。,玻璃微电极金属电极（钢、钨等）：,2）合格的微电极是记录细胞电位的重要条件：,（1）玻璃微电极：,硬质玻璃管拉制的玻璃微管,尖端直径 = 或1m,导电性：微电极内充灌盐溶液,2%旁安天蓝0.5 mol /L 醋酸钠（PH 7.7）,标记电极尖端位置,通阴极电流210A/min,微电极电阻：520 M,电阻过小： 1-2M 表示电极尖端可能折断；电阻过大： 20 M 表示电极中可能有气泡。,细胞内记录： 10-20 M 细胞外记录：5-6 M,（2）金属微电极：,优点：电阻低，机械强度高。常用作慢性埋藏电极。 制作较复杂，常用钢、钨（直径0.230.25mm）, 其中钨丝金属微电极较为常用。,三、电压钳技术 (The Voltage-Clamp Method),离子流,形成动作电位的基础,电压钳技术,维持在一个固定水平,了解各种离子在细胞活动过程中的跨膜规律将欲研究的单一离子流从众多复合的离子流中分流出来,电压钳：定量测定细胞兴奋时的离子电流的方向、振幅和时程。,负反馈放大器,电压钳技术的局限性,电压钳是通过控制膜电流研究离子通道.1)不能测定单一通道电流,因为钳制的膜面积 较大,包含大量随机开放或关闭的离子通道; 且背景噪音大,可掩盖单一通道的电流;,2)对体积较小的细胞进行此实验技术上有困难 (单个细胞上需放置两根电极).,膜片钳技术(The Patch-Clamp Method),1-3个离子通道!,离子通道模型的提出及实验证明,20世纪60年代, Hodgkin 和 Huxley 利用枪乌贼巨大轴突，分析了动作电位的产生，并在此基础上建立了Na+ 、K+ 通道模型。,1972年：Katz在对神经肌肉接头后膜的研究中，记录到 n型Ach受体（nAchR）离子通道的电导、平均 开放时间和开放频率。1976年：Neher和Sakman用膜片钳技术记录到nAchR单个 离子通道电流，并因此获1991年度诺贝尔奖。1981年：Miledi将生物合成的nAchR的cRNA注射到非洲 爪蟾的卵母细胞中，在卵母细胞膜上表达出这 种离子通道的受体。1983- Numa用重组DNA克隆技术，确定了分子量为 1984： 20余万的电鱼电器官的nAchR和Na+通道的全 一级结构。,记录单通道电流的膜片钳技术,膜片钳技术记录离子通道电流方式有四：1. 细胞密着式 (cell-attached) 将电极尖端以 G 封接在细胞表面，记录被封在电极 尖端口下的膜片中的离子通道的电流。Neher和Sakman 使用这种方法首次记录到了nAchR 单通道电流。2. 膜内向外式 (inside-out) 在细胞密着式 基础上，再将电极拉开，使之与胞体脱 离，即记录封在电极尖端口下的膜片中的离子通道电 流。,3. 全细胞记录 (whole-cell recording ) 在细胞密着式 基础上,向电极内稍施负压，使被封在 电极尖端口下的膜片破裂，用以记录全细胞离子通道 电流。4. 膜外向外式 (ourside-out) 在全细胞记录基础上，再将电极拉开，使之与细胞脱 离，此时附在电极尖端的膜片又可自动将电极尖端口 封住，此时膜片的外侧面向外，用以记录封在电极尖 端口下的膜片中的离子通道电流。,谢谢,四、膜片钳记录,电压钳技术是通过控制膜电位来研究离子通道的理想技术，但并不能测定单一通道电流。,细胞内测量电流时：,背景噪音至少100pA,足以掩盖仅有几个pA的单通道电流,这种显然极负的信噪比，几乎构成了以单个通道为目标的电生理学测量的不可逾越的障碍或难题,为解决上述难题，发展了膜片钳技术。,使所吸附膜与周围膜完全绝缘,微吸管,细胞膜微小片区（1-10m）,将其余大片细胞膜产生的噪音有效隔离，从而测出单个通道的微小电流（1pA）。,将传统的电生理学方法提高到分子水平,（一）记录方式：,1）细胞贴附式：,高阻封接时，微吸管尖贴附在细胞上，在细胞膜表面隔离出一小片膜，记录单通道电流。,2）内面朝外式：,高阻封接后 ，轻提微吸管尖可形成内面朝外的膜片。,3）外面朝外式： 通过给微吸管一个极短促的抽吸，或给微吸管一个极其短暂而大的电压变动（1ms,300400mv），或关掉放大器，再接通，是微吸管尖所隔离的膜片弄破，即可形成外面朝外的膜片。,4）全细胞式： 在形成外面朝外过程中，要经过全细胞式阶段。其与细胞内微电极记录形成基本相同。,诱发电位在临床已广泛应用，但假阳性及假阴性结果不时会出现在诱发电位检查中。 因此在记录过程中，实验条件、实验技术等方面必须严格控制，对异常电位的判断要严格、全面地加以分析。根据解剖、生理等各方面的知识才能对所记录到的电位变化作出比较合乎实际的解释。,正常情况下，随着肌肉张力增加，参加收缩的运动单位