【毕业学位论文】（Word原稿）山羊瘤胃和草鱼肠道微生物分子生态研究及β-葡萄糖苷酶基因的克隆生物化学与分子生物学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 山羊瘤胃和草鱼肠道微生物分子生态研究 及 2 I 摘 要 动物胃 肠道存在着大量的微生物群落 ， 构成了动物消化道微生物区系 ， 这些微生物群落是动物长期进化的结果 ， 它们和机体的免疫功能、营养需求等都有着密切的关系。 微生物生态的监测及其群落多样性分析是微生物生态学研究所采用的重要技术手段和内容。基于核酸序列分析的现代分子生物学技术可以用来检测不可培养微生物的种类 ， 完善微生物的分类系统 ，从而更真实的反映环境微生物的群落结构。植食性动物胃肠道存在大量可降解纤维素和半纤维素的微生物，分泌并应用大量纤维素降解酶类。因此，对于植食性动物胃肠道微生物的分子生态、纤维素酶类多样性及功能研究在理 论研究和生产实践中具有重要的意义。 本研究应用变性梯度凝胶电泳技术研究动物胃肠道微生物分子生态。利用 16S 8S 因的变性梯度凝胶电泳技术对三种山羊（波尔山羊、内蒙古绒山羊、四川南江黄羊）瘤胃细菌以及原虫的 优势菌群结构进行了比较分析。研究结果显示 谱中条带数目少于 16S 谱，并且条带分离效果明显，更有利于分析瘤胃细菌群落组成。 种山羊瘤胃细菌均具有一定的相似性，种内个体间相似性明显高于种间相似性，这说明 宿主品种是影响瘤胃细菌 种群构成的一个重要因素 。而原虫种内相似性并不高于种间相似性。 利用同样方法对草鱼肠道不同区段 优势菌群结构进行了比较分析。研究结果表明消化道存在着丰富多样的细菌群落，对 纹图谱聚类分析表明菌群组成相似性高于 77%。其中中肠和后肠的细菌多样性高于前肠，这可能与摄食饵料在消化道推移有关。 另外，以饲喂单一牧草的草鱼肠道为研究对象，筛选到 具有不同纤维素酶活性的菌株 90多株。然后根据菌落形态和水解圈差异结合 16S 终分离到 15株具有不同纤维素水解能力的细菌菌株。基于 16S 析发现，分离菌株分别属于 希瓦氏菌属（ 气单胞菌属（ 芽孢杆菌属（ 沙雷氏菌属（ 克雷伯氏菌属（ 变形杆菌属（ 肠杆菌属（ 柠檬酸杆菌属（ 进一步 建立了一种快速筛选和评价属于糖基水解酶家族 1的 码新基因的方法。纤维素降解领域具有重要的应用价值。 通过对发 表酶氨基酸序列的同源比较，设计了一对简并引物，利用同源克隆技术，在 15株细菌中克隆得到 11条编码 相互之间氨基酸相似性在 50%到 98%之间。 实验结果 证实了这种快速筛选基因方法的有效性。 通过基因组文库筛选，从 芽孢杆菌属、气单胞菌属和变形杆菌属中分别 获得了 三个 别命名为 这 三 个基因同已 注册 的 葡萄糖苷 酶基因序列的 最高 相似性分别为 88%、 72%和 82%。 它们与已报道的进行过功能验证的来源于 基酸相似性最高，分别为 说明它们是新的 关键词： 胃肠道微生物，分子生态，变性梯度凝胶电泳， 基因克隆 he of is by of GI a on in on 6S of a to be of a of of of a of by in of on of in of as as of at in of 6S as a of of (CR 6S of NA 8S to of to of of to be In in no of in 6S in of 7%. in in to is a to of a to 6S an is in a of of of A of be by of to 0% 8%. of of By NA as of 8%, 72% 2%, 录 第一章 引 言 . 1 1 16S 因克隆文库 . 2 2遗传指纹技术（ . 3 性梯度凝胶电泳（ . 4 链构象多态性（ . 6 端限制性片段长度多态性（ . 6 机扩增多态性分析（ . 7 3核酸分子杂交技术 . 7 点（ 交（点渍杂交） . 8 光原位杂交技术（ . 8 因芯片技术（ . 9 4实时荧光定量 术（ . 9 5微生物群落功能多样性的研究 . 10 基因组文库（ . 10 境基因组标签法（ . 11 6问题与展望 . 12 本研究的目的和意义 . 13 第二章 胃肠道微生物生态研 究 . 14 第一节 山羊瘤胃微生物遗传多样性研究 . 14 1实验材料 . 14 料 . 14 种和质粒 . 14 具酶 . 14 器和试剂 . 14 液 . 14 养基 . 15 2研究方法 . 15 提取 . 15 增 . 15 泳凝胶制备 . 17 泳 . 17 泳条件 . 17 段的回收和连接 . 18 泳 . 18 收 . 18 段的连接 . 18 V 受态细胞的制备 . 18 转化 . 19 组 纯化 . 19 化 . 19 组 子筛选 . 19 序 . 20 谱中部分优势条带的序列分析和系统发育分析 . 20 3结果与分析 . 20 提取及 增 . 20 纹图谱建立及分析 . 22 分优势条带的序列比对与系统发育树分 析 . 28 4讨论 . 29 第二节 草鱼肠道细菌多样性分析 . 32 1实验材料 . 32 料 . 32 种和质粒，工具酶，仪器和试剂，溶液，培养基 . 32 2研究方法 . 32 鱼肠道的处理 . 32 提取 . 32 增 . 33 性梯度凝胶电泳 (. 33 段的回收和连接，感受态细胞的制备，电转化，重组子筛选 . 33 序 . 33 谱中部分优势条带的序列分析和系统发育分析 . 33 3结果与分析 . 33 提取及 增 . 33 纹图谱建立及分析 . 34 分优势条带的序列比对与系统发育树分析 . 36 4讨论 . 37 本章小结 . 40 第三章 草鱼肠道产纤维素酶可培养细菌的分离鉴定及系统发育分析 . 41 1实验材料 . 41 料 . 41 液 . 41 验仪器 . 41 养基 . 41 2 研究方法 . 41 鱼肠道的处理 . 41 维素酶产生菌株的分离 . 42 维素酶产生菌株的初筛 . 42 维素酶产生菌的纯化 . 42 纤维素酶产生菌的保藏 . 42 因组总 提取 . 42 6S 增 . 42 段的回收 . 43 序 . 43 统发育进化树的构建 . 43 3结果与分析 . 43 株分离筛选结果 . 43 株 16S 定结果 . 43 菌基因组 提取结果 . 43 6S 增和测序 . 45 6S 列相似性比较以及系统发育学分析 . 46 4. 讨论 . 48 本章小结 . 50 第四章 . 51 1实验材料 . 51 株与质粒 . 51 物合成 . 51 剂盒、工具酶和生化试剂 . 51 2实验方法 . 51 . 51 段的回收和连接，转化，重组子筛选， 序 . 52 . 52 统进化树分析 . 52 因文库的构建和筛选 . 52 3结果与分析 . 54 . 54 . 55 统进化树分析 . 58 因文库的构建和筛选 . 58 列 . 59 4讨论 . 65 本章小结 . 68 第五章 结论 . 69 参考文献 . 71 致谢 . 80 作者简历 . 81 中国农业科学 院博士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 现代分子生物学技术在胃肠道微生物生态系统研究中的应用 二十一世纪人类面临资源紧缺、环境污染、生态破坏等一系列严峻的挑战。其中资源问题已经成为人类社会，特别是 像 中国这样的发展中人口大国可持续发展的最主要瓶颈 之一 。生物技术对于克服和解决这些问题具有无可替代的重要作用（孙国凤 等 , 2005）。资源生物技术目前发展迅速，正在 酝酿重大突破，逐步形成生物技术的第三次浪潮，将对人类经济社会发展产生巨大的引领和带动作用。 生物质资源是地球上最重要的可再生性资源。随着世界人口迅速增长、石油等矿产资源日渐枯竭，发展和提高人类生产和利用生物质资源的能力，特别是发展能在干旱、盐碱等贫瘠地区实现作物高产的高效农业，和转化生物质资源为现代生物产品的高效生物加工业显得特别重要（翁伯琦等 , 2006; 赵军等 , 2007）。开发高效转化可再生生物资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及轻工、化工产品，可以推动未来经济体系的基 础从逐渐枯竭的石油资源向可再生的生物质资源转化，构建可持续发展的循环型社会，具有极其重要的意义和光明的发展前景 （石元春 , 2005） 。 微生物是地球上最早的生命形式，在数十亿年的进化过程中，形成了适应各种环境的生理和分子机制，占据了地球几乎所有环境，包括没有其它生命形式能够共存的极端环境。微生物支撑着整个地球上的物质循环和生命的持续，其多样性被用于监视和预测环境变化，也是新基因资源的重要来源（ et 2002; et 2007）。尤其人类和动物胃肠道中栖息着大量 的微生物，它们在营养、生理、免疫等方面对宿主起着有益作用 （ et 1997; et 2004, 2006） 。虽然传统纯培养方法已经解开了大量微生物的很多秘密，但是人们对胃肠道微生物了解还很有限，其原因有很多方面： 1 由于长期进化，微生物通常是在特定环境条件下才能正常生长和繁殖，迄今，通过分离、培养，只有很少数的微生物得到了鉴定和描述，而绝大多数微生物仍然是未知的； 2 很多研究证明，自然界中很多微生物不能人工培养，成为不可培养微生物 （ et 1995） ； 3 人为培养的微生物与其自然界菌体在形态和特征上差异明显 （ et 1984; et 1987）。微生物生态的监测及其群落多样性分析是微生物生态学研究所采用的重要技术手段和内容，其最终目的是快速、准确鉴定在自然生态环境或