一株药用红树内生真菌Stemphyliumsp次级代谢产及抗菌活性研究

1、题目：一株药用红树内生真菌 Stemphylium sp. 33231 次级代谢产及抗菌活性研究姓姓 名：名： 学学 号：号： 专专 业：业： 制药工程制药工程 年年 级：级： 2010 级级 系系 别：别： 制药工程制药工程 学学 院院: 化学与化工化学与化工 完成日期：完成日期： 2014 年年 5 月月 指导教师：指导教师： 本科生毕业论文（设计）独创性声明 本人声明所呈交的毕业论文（设计）是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文（设计）中没有抄袭他人研究成果和伪造数据等行为 。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文（设计）

2、中作了明确的说明并表示谢意。论文（设计）作者签名： 日期： 本科生毕业论文（设计）使用授权声明海南师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交毕业论文（设计）的复印件和磁盘，允许毕业论文（设计）被查阅和借阅。本人授权海南师范大学可以将本毕业论文（设计）的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存、汇编毕业论文。论文（设计）作者签名： 日期： 指 导 教 师 签 名： 日期： 1目 录1 引言.41.1 研究背景及意义.41.2 GENUS STEMPHYLIUM 吡喃酮类次级代谢产物成分研究进展.41.3 GENUS STEMPHYLIUM 次级代谢产物抗菌活性研

3、究进展.52 实验部分.52.1 实验仪器与试剂.52.2 实验方法.63 结果.83.1 化合物结构解析.84 抗菌实验.104.1 仪器与方法.105 结论.12致谢.12参考文献：.13附录一 部分化合物核磁谱图.142一株药用红树内生真菌 Stemphylium sp. 33231 次级代谢产物及抗菌活性研究作者： 指导教师：（大学 化学与化工学院， ）摘摘 要：要：红树植物处于亚热带、热带的海陆交界处，因高盐度的生长环境使红树根部长期处于缺氧状态，并长年受高强光照射。红树植物特殊的生长环境，导致其富含能适应特殊生存环境的特殊内生微生物。这些微生物能产生结构独特、活性显著的次级代谢产物

4、，使得药用红树内生真菌成为活性海洋天然产物的重要来源。尖瓣海莲（Brguiera sexangula var. rhynchopetala）为海南特有药用红树，民间常用于治疗疟疾。目前，关于红树尖瓣海莲化学成分研究己有文献报道，然而对其内生真菌的分离及生物活性研究尚未见报道。本研究首次对一株红树尖瓣海莲来源的内生真菌Stemphylium sp. 33231的次级代谢产物进行了分离并对其抗菌活性做了测试。通过柱层析、薄层层析、高效液相等方法，从尖瓣海莲的一株内生真菌 Stemphylium sp. 33231 中共分离得到 3 个单体化合物。并通过 1H-NMR, 13C-NMR，MS 等波谱

5、技术及其理化性质对化合物进行了结构鉴定，鉴定分别为：Infectopyrone A 和 B，2-(2 S-hydroxypropyl)-5-methyl-7-hydroxychromone。抗菌活性结果表明 Infectopyrone A 和 B 对 7 种陆地致病菌抑制活性具有选择性。关键词关键词：内生真菌；Stemphylium sp.；次级代谢产物；吡喃酮；抗菌活性Study on Metabolites of Endophytic fungi antibacterial activity Stemphylium sp. 33231 Drived from medicinal mangr

6、oveAuthor:Liang Chunmei Tutor: Professor Chen Guangying(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hainan Normal University,Haikou, 571158)Abstract: Mangroves are living in the subtropics and tropics junctions of land and sea. Because of its growth environment with high salinity makes mangrove r

7、oots in hypoxia condition for a long time, and suffers from the strong light irradiation all the year round. Mangroves special growth environment can lead to its be rich in special endophytic microbe to adapt to the special environment. 3These microbes can produce the secondary metabolite with the u

8、nique structure activity significantly and make the medicinal mangroves endophytic fungi becoming a important resource of activity marine endemism products. Brguiera sexangula var. rhynchopetala as the endemic medicinal mangrove are used in treating against malaria among the people. At presently, it

9、 has been appeared in the document reports about the chemical composition of mangrove Brguiera sexangula var. Rhynchopetala. However, they have not been reported in literature about the separation of endophytic fungi. This research is the first, carried the separation out about the secondary metabol

10、ite of Stemphylium sp. 33231 from a mangrove Brguiera sexangula var. Rhynchopetala and made a test about its antimicrobial activity. By column chromatography, thin layer chromatography, high performance liquid and so on, it has separated the three mono compounds from a Stemphylium sp. 33231 of Brgui

11、era sexangula var. Rhynchopetala. And it has also made a structural identification for its chemical compound by spectrum technology ,1H-NMR, 13C-NMR，MS and so on, and its physical and chemical properties. The identifications are Infectopyrone A and B2-(2S-hydroxypropyl)-5-methyl-7-hydroxychromone.Th

12、e result of antibacterial activity shows that Infectopyrone A and B have an inhibitory activity selection to seven kinds of land pathogenic bacterium.Key words: Entophytic Fungus; Stemphylium sp.; Secondary Metabolite; Pyranone ; Antibacterial Activity 本研究已确定的化合物结构：本研究已确定的化合物结构：123OOHOOHOOOOOHOOOOHO

13、OHO41 引言引言1.1 研究背景及意义研究背景及意义红树林分布在热带、亚热带的海岸潮间带，是由海洋高等植物中的木本植物组成的群落1。中国共有红树植物 12 科 15 属 26 种（含有 1 变种） ，及半红树植物 9 科 10 属 11 种，其中发现具有药用价值的有 23 种2。民间药用的红树植物主要有 13 种, 包括海莲、正红树、红海榄、木榄、老鼠簕、秋茄、角果木、海漆、小花鼠簕、银叶树、海芒果、黄槿和海桑。其中尖瓣海莲（Brguiera sexangula var. rhynchopetala）是中国特有种3仅在海南有分布。我国民间用海莲或尖瓣海莲树叶水煮熬汁口服来治疗疟疾。另外有文

14、献报道，海莲树皮的提取物能有效地抑制 2 种肿瘤即肉瘤 180 (sarcoma 180) 和刘易斯肺癌(lewis lung carcinoma) 4；从该属植物中分离得到的化合物类型主要为三萜、二萜、黄酮、硫代化合物和生物碱类化合物5-11。然而因为资源匮乏，不可能无限地采集红树植物进行药物开发，使其在抗肿瘤药物的研发和应用中受到限制。因此研究其内生微生物的代谢产物来替代红树的开发具有重要意义。由于周期性的遭受海水浸淹，红树植物及其内生微生物为适应这一独特的生态环境，其代谢途径和生理特性都有着自身的特性12。 本文从一种红树尖瓣海莲中分离得到一株内生真菌 Stemphylium sp. 3

15、3231。匐柄霉属真菌（Stemphylium）为灰白色丝孢菌的一类重要的真菌；能在许多的植物上兼具寄生和腐生的特点；该菌菌落平展，褐色，灰色或者黑色，绒毛状或者棉絮状；菌丝体表生或者埋生。目前，已经从许多海洋来源的匐柄霉属真菌（Stemphylium）中分离获得了一些结构新颖，活性较好的次级代谢产物13, 14。1.2 genus Stemphylium 吡喃酮类次级代谢产物成分研究进展吡喃酮类次级代谢产物成分研究进展匍柄霉属真菌次级代谢产物种类繁多，其结构类型主要包括蒽醌及其二聚体类、吡喃酮类、二萘嵌苯类、内酯类、甾体类等。下面主要介绍一下吡喃酮类化合物的研究进展。2009年Debbab

16、Abdessamad从匍柄霉属真菌中分离得到1个吡喃酮衍生物2H-Pyran-2-one (1)。2003年Ostenfeld Larsen从匍柄霉属真菌中分离得到1个吡喃酮5衍生物2,4-Hexadienoic acid (2)。1996 Andersen Brigitte从匍柄霉属真菌中分离得到1个吡喃酮衍生物Stemphylone (3)。1964 Grove John Frederic从匍柄霉属真菌中分离得到3个吡喃酮衍生物4H,5H-Pyrano (4), 2,4,6-Octatrienoic acid (5) 和2H-Pyran-5-carboxylic acid (6)15。(图

17、1-2)OOHOOOOOHOOOOCOOHOOOHOOOOOHOOOn-PrOOHOO123456图 1-21.3 genus Stemphylium 次级代谢产物抗菌活性研究进展次级代谢产物抗菌活性研究进展2012年Abdssamad Debbab等发现匍柄霉属真菌代谢产物Alterporriol D对致病菌Strept. Pneum、MRSA具有抑制作用其IC50均为31.2 g/mL，Alterporriol E对致病菌Strept. Pneum、Enterc. Faecalis、Enterc. cloacae具有抑制作用其IC50均为31.2 g/mL， Alterporriol N对

18、致病菌Enterc. Faecalis具有抑制作用其IC50为15.63 g/mL。2 实验部分实验部分2.1 实验仪器与试剂实验仪器与试剂2.1.1 实验仪器实验仪器SPH-111B 标准型大容量恒温培养振荡器：Rocking Incubation SPH-111B低分辨质谱仪：Finnigan-MAT-95-MS 核磁共振仪：Bruker AV-400MHz (瑞士 Bruker 公司)；旋转蒸发仪(EYELA)；EYELA COOLACE CA-IIII 冷却水循环装置（日本东京理化有限公司） ；YOKO-ZX 紫外分析暗箱（武汉药科新技术开发有限公司） ；64001N 电子天平（上海民

19、桥精密科技仪器有限公司） ；SR5200LH 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司） ；恒温水浴锅 B-220（上海亚荣生化仪器厂） ；PTHW 大型电热套；大烧瓶及回流装置（河南豫华仪器有限公司） ；SHB-III 循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司） ；101A-0 型数显电热鼓风干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司） ；Fuhe 800 电动离心机（金坛市富华仪器有限公司） ；色谱柱（各种规格普通玻璃加压柱）2.1.2 试剂试剂石油醚（6090）AR广东西陇化工股份有限公司氯仿AR广东西陇化工股份有限公司乙酸乙酯AR广东西陇化工股份有限公司丙酮AR广东西陇化工股份有限公司甲醇A

20、R广东西陇化工股份有限公司乙醇食品级海南海口硅胶（柱层析用）200-300 目海南师范大学葡聚糖 LH-20 凝胶Sephadex LH-20Amersham Blosclences 公司薄层色谱板Kieselgel 60 F254 Kieselgel 60RP-18WF254SMerck 公司反相硅胶C-18Merck 公司TLC 显色剂： 香草醛-浓硫酸显色剂 2.2 实验方法实验方法2.2.1 菌种培养菌种培养菌株 Stemphylium sp.33231 是从一株红树尖瓣海莲来源的内生真菌（Stemphylium sp. 匍柄霉菌） 。该菌以大米为营养物，进行大规模发酵（35Kg大米分

21、装于 200 个在 1L 锥形瓶，接入该菌株，室温下静置培养发酵，29 天后7收集发酵物，萃取浓缩后获得乙酸乙酯浸膏） 。图 2-1 菌株 33231 在 PDA 上的生长图，及大米发酵图2.2.2 分离纯化过程分离纯化过程对发酵浓缩后乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱层析。总浸膏以 1 : 2 体积拌硅胶（100-200 目）进行硅胶柱层析（过大柱） ，以石油醚（PE）/乙酸乙酯（EA）/甲醇进行梯度进行洗脱，得到 8 个组分 Fr. 17。本工作主要对 20% EA 和 40% EA 洗脱下的部分 Fr. 6 进行分离鉴定。 （图 2-2）乙酸乙酯浸膏减压硅胶柱层析梯度洗脱EA/PE=5EA/PE=1

22、0%EA/PE=20%EA/PE=40%EA/PE=60%EA/PE=80%EA/PE=100%MO=100%Fr.1Fr.2Fr.3Fr.4Fr.5Fr.6Fr.7Fr.8图 2-2 乙酸乙酯浸膏粗分8Fr. 6 组分的分离纯化过程总过程如图 2-3 所示。图 2-2 Fr. 6 分离过程6-1 组分经 TLC 检测后发现，有一个主点，用凝胶柱以氯仿甲醇(1 : 1)进行洗脱纯化，洗脱后得到化合物 3 (4.2 g)。6-2 组分经 TLC 检测后发现点多量少，选择放弃。6-3 组分经过硅胶柱洗脱，TLC 检测合并相同极性组分得到 6-3-13。其中组分 6-3-1 经 TLC 检测，有一主

23、点，另有部分阴影。尝试用氯仿/甲醇=1:1 洗脱纯化，得到 6-3-1a (1) 8.6 mg。6-3-2 以用氯仿/甲醇=1:1 洗脱纯化,得到 6-3-2a（2）9.3 mg。3 结果结果3.1 化合物结构解析化合物结构解析通过1H-NMR 及13C-NMR 等波谱表征以及结合理化性质，对从 Fr. 6 组分中分离得到的化合物 13 进行化学结构的鉴定。化合物 1 为淡黄色无定型粉末，溶于甲醇、氯仿，其 TLC 板在紫外灯下显9火焰状暗斑。在氢谱中低场存在三个烯族的氢信号 H 6.88 (1H, br s)，6.70 (1H, br s) 和 5.79 (1H, br s)，高场存在一个连

24、氧亚甲基信号 H 4.22 (2H, s)，一个甲氧基信号 H 3.98 (3H, s)和两个甲基信号 H 2.09 (3H, s)、2.25 (3H, s)。从碳谱可知含有两个甲基，一个甲氧基，一个连氧亚甲基，八个烯碳一个，一个酯羰基及一个羧基碳。从这些数据我们可以知道该化合物为吡喃酮类化合物。综合以上氢谱和碳谱数据以及理化性质，并与文献16数据进行对照，确定化合物 1 为Infectopyrone A表 3-1 化合物 1 与 2 的 NMR 数据1 (in DMSO-d6)2 (in CDCl3)positionH (400 MHz)C (100 MHz)H (400 MHz)C (10

25、0 MHz)1-167.1, C-169.8, C25.79, br s121.5, CH5.87, br s119.6, CH3-150.4, C -154.6, C46.88, br s133.9, CH7.13, br s135.6, CH5-129.6, C-128.8, C2-162.7, C-163.8, C3-105.4, C-103.3, C4-167.4, C-168.5, C56.70, br s95.4, CH6.32, br s94.0, CH6-160.2, C-161.5, C74.22, s52.1, CH24.41, s63.1, CH23-Me2.25, br

26、 s18.6, CH32.36, br s19.4, CH35-Me2.09, br s14.0, CH32.13, br s14.2, CH34-OMe3.98, s57.0, CH34.01, s56.7, CH37-OMe-3.43, s58.4, CH3化合物 2 为淡黄色无定型粉末，溶于甲醇、氯仿，其 TLC 板在 254nm 的紫外灯下显暗斑。在氢谱中低场存在三个烯族的氢信号 H 7.13 (1H, br s)，6.30 (1H, br s) 和 5.87 (1H, br s)，高场存在一个连氧亚甲基信号 H 4.41 (2H, s)，两个个甲氧基信号 H 4.01 (3H, s)

27、、H 3.43 (3H, s)和两个甲基信号 H 2.13 (3H, s)、2.36 (3H, s)。从碳谱可知含有两个甲基，两个甲氧基，一个连氧亚甲基，八个烯碳一个，一个酯羰基及一个羧基碳。从这些数据我们可以知道该化合物为吡喃酮类化合物。综合以上氢谱和碳谱数据以及理化性质，并与文献16数据进行对照，确定化合物 1 为 Infectopyrone A10化合物 3 为针状晶体，溶于乙酸乙酯、甲醇，在 254 紫外灯下显暗斑。在1H NMR 谱图中，一对间位耦合质子氢信号 H 6.62 (1H, d, J = 2.4Hz)和 H 6.60 (1H, d, J = 2.4Hz)，一个烯氢氢信号 H

28、 5.96(1H, s)，一个亚甲基信号 H 2.57 (2H, m)，一个连氧次甲基信号 H 4.02 (1H, m)和两个甲基信号 H 2.65(1H, s)， H 1.14 (1H, d, J = 6.4Hz)。13C-NMR 谱图中共有 13 个碳信号包括 1 个羰基碳信号，8 个芳香碳信号，一个连氧次甲基信号，一个亚甲基信号和两个甲基信号。基于以上分析，该化合物可能为原色酮类化合物。综合分析谱图数据和理化性质，发现文献该化合物与报道的17 2-(2S-hydroxypropyl)-5-methyl-7-hydroxychromone 数据基本一致，因此化合物鉴定为 2-(2S-hyd

29、roxypropyl)-5-methyl-7-hydroxychro mone。表 3-3 化合物 3 的 NMR 数据化合物( DMSO-d6)文献值 (Acetone-d6)position1H13C1H13C2164.7164.635.96, s114.45.96, s111.94178.2178.55141.4142.266.60, dd (2.4, 0.8)116.56.60, dd (2.4, 0.8)116.37160.9160.786.62, d (2.4)114.46.62, d (2.4)110.792.57, m42.82.57, m43.3104.02, m64.04.

30、02, m64.0111.14, d (6.4)23.41.14, d (6.4)22.9122.65, br s22.42.65, br s21.94a111.5115.38a159.2159.74 抗菌实验抗菌实验4.1 仪器与方法仪器与方法4.1.1 致病菌致病菌株株将 7 株陆地致病菌（菌种保存于海南师范大学省部共建-热带药用植物化学教育部重点实验室）用于实验，7 株陆地致病菌包括：白色葡萄球菌 11(Staphylococcus albus)、大肠杆菌 (Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococc

31、us aureus)、四联球菌 (Micrococcus tetragenus)、藤黄八叠球菌 (Micrococcus luteus)和蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)。4.1. 2 测试测试对象对象化合物 13。4.1. 3 仪器仪器移液器、250mL 锥形瓶、酒精灯、96 孔微量稀释板、超净工作台、接种针、酶标仪(ELx800)、高温灭菌锅、电子天平、恒温振荡器、恒温培养箱。4. 1.4 细菌培养基细菌培养基采用 LB 培养基：胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠 10g/L，蒸馏水。4.1.5 实验方法实验方法采用微量稀释法，该方法常用于测定致病菌对敏感性

32、药物或新药对细菌的抑制活性试验。一般使用 96 孔微量稀释板，其孔底呈 U 型，每孔容量0.200.30 mL 本法操作较方便，且培养基用量少，可用于大批量药敏试验。一般用 MH 培养基，将已配制好的药液在试管中作二倍浓度递减稀释，分别装于96 孔板内或者用微量加液器直接在板孔内作二倍稀释，然后再接种稀释菌液，另外需留出一列孔作为药液对照，该孔列仅加培养基和菌液作为菌对照，试验完毕后，用微量搅拌器震荡混匀，再将 96 孔板置于 37 培养箱中温孵 1822 h，用酶标仪测 630 nm 下吸光度。4.1.6 操作步骤操作步骤(1)致病菌株的准备 将活化好的 7 株致病菌分别接种于以灭菌处理过的

33、 LB 培养基中，再将其放置于恒温振荡器中 37oC 震荡培养 612 h。(2)化合物的初筛将培养好的致病菌用培养液进行稀释，稀释度为 1: 500-1:1000；将稀释后的含菌培养液分别定量加至 96 孔板的各个孔中；将样品配制成 1mg/mL,分别取定量加至各个孔中。加完后置于恒温培养箱中 37oC 恒温培养，而后用酶标仪在12630nm 下测各孔吸光度。(3) 最小抑菌浓度的测试 将培养好的致病菌用培养液进行稀释，稀释度为 1: 5001:1000；将稀释后的含菌培养液分别定量加至 96 孔板的第一排各孔中，让后一次向下成倍稀释；然后将各样品分别加入至各列孔中。加完后置于恒温培养箱中

34、37oC 恒温培养，而后用酶标仪在 630nm 下测各孔吸光度。4.1.7 实验结果实验结果MIC (g mL-1)CompoundS. albusE. coliB. subtilisM. tetragenusM. luteus15.0 2.5 10.0 10.0 10.0 210.0 2.5 20.010.0 10.0 320.020.020.020.020.0Ciprofloxacin1 0.6 0.3 0.6 0.3 0.3 5 结论结论本研究对一种尖瓣海莲内生真菌 33231 的发酵物进行了分离纯化以及结构鉴定。首先通过乙酸乙酯浸提得到粗提物浸膏，将浸膏进行柱层析，对 60%乙酸乙酯洗

35、脱下的部分进行了进一步的细分，主要采用硅胶柱层析法和凝胶柱层析法、高效液相法进行了分离纯化得到 3 个单体化合物，最后通过现代波谱学方法对所得化合物进行了结构鉴定。对所得化合物进行抗肿瘤活性研究，结果表明：化合物 1，2 显示具有较好的抗菌活性化合物 1 和 2 对 E. coli 的抑制活性达到了 2.5 gmL-1。致谢致谢在论文完成过程中，我的内心很感恩，特此我要诚心的感谢所有帮助我，支持我的老师，同学和学长。首先，我要感谢的是我的指导教授，我的论文是在教授的指导教导下完成的。陈老师严谨的工作态度给我留下了深刻的印象，使我受益匪浅。我衷心感谢我们实验室的学长在专业知识和实验技术上给予我的

36、一一指导和帮助，感谢学长给我提供了撰写论文的各种素材，修正我的论文，给我的论文进行排13版，我的论文的完成离不开学长的帮助，在这里请接受我真诚的谢意。我还要感谢我的毕业小组的成员，谢谢在平时做实验的过程中对我的各方面的帮组和支持。14参考文献：参考文献：1 林鹏, 傅勤. 中国红树林环境生态及经济利用M, 北京: 高等教育出版社,1995: 159.2 林鹏. 中国红树林生态系M, 北京：科学出版社 1997: 4752.3 王伯荪, 梁士楚, 张炜银, 等. 世界红树植物区系J. Acta. Bot. Sin. 2003: 644653.4 Kokpol U., Chemistry of n

37、atural products from mangrove plants, UNDP / UNESCO, Training course on life history of selected species of flora and fauna in mangrove ecosystem J. Thailand 1985: 159169.5 Laphookhieo S., Karalai C., Ponglimanont C., et al. Pentacyclic triterpenoid esters from the fruits of Bruguiera cylindrical J.

38、 J. Nat. Prod. 2004: 21412153.6 Chumkaew P., Kato S., Chantrapromma K. A new triterpenoid ester from the fruits of Bruguiera parviflora1 J. Chem. Pharm. Bull. 2005: 9596.7 Bao S. Y., Deng Z. W., Fu H. Z., et al. Diterpenes and disulfides from the marine mangrove plant Bruguiera sexangula var1 rhynch

39、opetala J. Helv. Chim. Acta. 2005: 321354.8 Subrahmanyan C., Rao B. V., Ward R. S., et al. Diterpenes from the marine mangrove Bruguiera gymnorhiza J. Phytochemistry 1999: 8390.9 Han L., Huang X., Sattler I., et al. New diterpenoids from the marine mangrove Bruguiera gymnorrhiza J. J. Nat. Prod. 2004, (67): 1620162310 Kato A., Takahashi J. A new naturally occurring 1,2-dithiolane from Bruguiera cylindrical J. Phytochemistry 1976 (15): 22022111 Kato A. Brugine from Bruguiera cylindrical J. Phytochemistry 1975 (14): 56