多通道微生物传感器水质毒性检测仪

化学品引起的环境污染事故频发，不仅造成巨大的经济损失，而且导致社会的不安定和生态环境的严重破坏。突发性水质污染已经成为我国用水安全和水环境质量的一个潜在，为预防突发性水质污染的发生和对已发生的污染迅速处置，建立水质污染统显得为必和迫。本研究小组针对现有生物传感器毒性分析技术存在的不足，研究开发了一种具有独立自主知识的多通道电流型微生物传感器，它通过选择固定不同的毒性敏感菌株，对污染物的毒性做出快速评价，可实现对常见毒性物质测定的标准偏差8%；微生物电极3月（4℃条件下）；丝网印刷电极可重复使用≥50次；以）p（1pp。应用研究表明，该微生物传感器与基于发光细菌的毒性检测仪和呼吸仪等相比，具性检测污染物范围宽、操作简单、不受样品色度和浊度干扰、毒性检测结果更具客观真实性等优势，且毒性分析结果与发光菌标准毒性分析方法具有良好的相关性，可很好适用于常规水质急性毒性分析和应急性环境监测。其推广应用对提升我国的环境监测能力和保障水环境生态安全具有重要实际意义，具有一定的经济、环境和社会效益。 1、项目研究背景及内 项目背 研究内 2、多通道微生物传感器的开 微生物传感器工作原 生物传感器电路工作原理及系统设 生物传感器软件系统开 生物传感器电极的开 3、多通道微生物传感器的分析性 测试步 微生物固定方法优 盐度对毒性分析的影 pH值对毒性分析的影 毒性分析重复 微生物电极的长期保存性 在重金属毒性分析中的应 在有机物污染物毒性分析中的应 与标准毒性分析方法的相关性分 现场应 4、与现有技术比 5、应用前景和效益分 6、总 1、项目研究背景及内容项目背水是生命之源，是维持人类生存和发展的重要因素。环境污染已经成为我国目前所大问题之一。国主要突发性境污染。这些交通事、人为坏、然原因和意外故所引的突发水污染，具有强的随性和可见性，果不发现，会对生和生活水安全造极大重，图1.1）。建立水质监测系统是世界公认和通用的避免、降低突发性污染的影响、保障源水水质和供水安全的可行方法(USEPA)。 表1.1近年来我国发生的部分水污 发 污时 水

事 主要原 染

重庆綦河a

重庆华强化肥有限公司排放的废

停止供水，重庆綦江古 街道桥河片区近3万居民，从2005年1月3日起 中石油吉林公司双苯厂苯胺

车间发 事基苯等以及松花江注入黑龙江 有机物的沿江俄罗斯大城市哈。 韶关冶炼厂设检修期

厂22日开始全面停产湘江株洲含镉废水突然流镉入国际上造成一定湖南省岳阳县新墙3家化工厂的工业污水砷砷10倍左右，8万居民的饮用水安全受到河和影响。独山县麻球河流域及下游三独山县三利公司制酸车间擅自违砷造成独山县172万人生活用水。都县都柳汀江流域紫金矿业下属企铜 鱼和鱼约达378万斤；到当地居民的 松花江 吉林省吉林市吉县新亚强化工1000多只装一氯硅烷烷的原料桶顺松花 图1.1由于突发性水污染具有极强的不可预见性和污染物的多样化学分析方法存在的问分析结果毒性物质对环境的综合影响设备复杂、分析费用偏检测时间较长，难以满足毒性物质污染的应急监测需要时检测，且不可能测所有能物质，时各种污物迭1.2所示），的技术保障。1.2迄今为止，人们提出了多种生物毒性测试方法用于水质毒性分,测技术领域新的研究热点。．、，．。毒性检仪和呼仪等比，具检测污物范实性等优势，可很好适用于常规水质急性毒性分析和应急性环境监参考文献SmoldersR,BervoetsL,BlustR.Insituandlaboratorybioassaystoevaluatetheimpactofeffluentdischargesonreceivingaquaticecosystems[J].EnvironPollut,2004,132(2):231.BentleyA,AtkinsonA,JezekJ,etal.Wholecellbiosensors—electrochemicalandopticalapproachestoecotoxicitytesting[J].ToxicolVitro,2001,15(4-5):469.黄正,任恕.微生物传感器在污染物生物毒性分析中的应用[JJTransducerTechnol,2004,23（9:4.卢玲,.鱼类急性毒性实验[J].生物学通报,陈其晨,张克俭,徐关文.重金属对鱼类毒性的综合研究[J].水产学报周杜挺,何可佳.氟虫腈等7种杀虫剂对鲫鱼的毒性及安全性试验研究[J].科学与管理,2006,25（9）:18.杨霓云,刘征涛,王宏霁.五氯苯酚与邻氯苯酚和2,4-二氯苯酚对斑马鱼的联合毒性[J].环境科学研究,2006,19(6):145.刘红玲,周宇,许妍,于红霞.[J].安全与环境学报JenningsVLK,Rayner-BrandesMH,BirdDJ，Assessingchemicaltoxicitywiththebioluminescentphotobacterium(Vibrioi):Acomparisonofthreecommercialsystems[J].waterresearch,2001,35(14):3448.张金丽,袁建军,郑天凌,席峰Microtox技术检测多环芳烃生物毒性的研究[J].态农业学报J.Trogl,S.Rippb,G.Kuncova,G.S.Sayler,A.Churavaa,P.Parıkd,K.Demnerova,J.H´alova,L.Kubicova.SelectivityofwholecellopticalbiosensorwithimmobilizedbioreporterPseudomonasfluorescens SensorsandActuators,2005,B107:阎鹏,孙礼,李百祥.利用发光菌快速检测环境污染物急性毒性的研究概况[J].环境与健康,2001,18(4),250.研究内丝网印刷电极的，优化具好一致性和重复利性能的生物传感器微电极；物电极最佳方法；进行微生物传感器在水质毒性分析中的实际应用性能研2、多通道微生物传感器的开微生物传感器工作原利用其氧化还原代谢反应产生电流的变化实现对待测物质毒性的定能（图2.1）M[ox]+e-→ M[red]→M[ox]+ 2.1生物传感器电路工作原理及系统设生物传感器电路生物传感器的硬件电路设计如图2.2，它主要由电极模块、信号放大模块、模数转化模块、MCU控制模块等组成。入MCU，MCU到模拟压信号经过简单的运算可以得C，进行显示和分析。此外，MCU模块控制时序产生模块产生相应的时序LD驱动模块后分别控制电机和电机指示灯的工作。模电电路特点

设计本电路时选定OPA413放大器，它具有噪声低、基极电流小和温度漂移优点，提高了仪器的精度。MCU电路在设计选择PC16876A单片机，本应用的趋势发展。PC16F876A6路10A/D转换器，完全能够满足测试时所需的精度要求。电源管理电路：在野外没有直流或交流电供电的场合，由器正常工作。生物传感器电路系统设括：主控制板1、信号板2和电源控制板3组成，其对应的电路2.4、2.62.8PCB图分别见2.5、2.72.9。2.3板1：信号处理传输与电机控制板3及其他：小转接板和电机控

2.4图2.5PCB信号8路电极电压模拟信号从板1接插件CONN7-10的左边进入ADG408BN（U8-11）将模拟数据选择后送给ADC--ADS128（U12换后的数字量（ADOUT）送给单片机。ADC的参考电压由LM336（ZD1）电路提供。8路检测数字信号从板1接插件CONN7-10的右边进入，然后经过并行数据转串行送给单片机。555定时器（U23振荡频率信号输出送给计数器74HC165（U20产生的一路串行数据（BCDATA0。BCDATA0经过移位器HCF4094（U21）转换成并行数据，再经过肖特基整流管管6CW（Q5-12）控制电机指示灯。移位器HCF4094（U21）的串行输BCDTA0HCF409（U22）转换成并行数据，再经过N沟道场效应管9956A（Q1-4）做为电机驱动信号。单片机连接了一个I2C转并口PCF8574（U17）和一片I2C器24C1（U13同时有一个I2C接口（CONN11）和（CONN12板2：信 和初步处

注：SGND和GND通过板1连接

图图2.6图2.7板的PCB有8路信号通道。每路通道两个电极间的电压差。其VR1改变公共电极的直流电压值，从而改88路检测数字信号。1212348765t12348765t123487652.8图图2.9PCB过三端稳压管（L7805CVL7905CV）将电压值稳定在12V，±5V，生物传感器样机开发的多通道生物传感装置结构见图2.10，它是由1-10组毒性测通道和控制与检测系统7组成。毒性检测通道由毒性测试单元构成，每组毒性测试单元均由电极插座板（1、微生物电极（2、测试槽（3、磁力搅拌器（4）和磁子（6）组成，测试槽（3）的下面配置有一一对应的磁力搅拌器（4，且测试槽（3）和电极插座板（1）12.102.11 总结

图2.12低失调电流的放大电路设计提高了仪器的精度性。生物传感器软件系统开件编程语言为C++，开发IDE为VisualStudioC++6(sp6)。2.13模本模块主要是通过串口从传感器设备中电流数据，主要Command.cpp文件中的 停止位、奇偶校验等andatamplng开始采后发送开始指令，设备开始数据。线程然后通过串口循环感器设备中的电流数据，并通过类and的成员函数ocessRxBuerandCbOnatestAddiionandCb::OnData处理收到的数据。内存对本模块主要是将的原始电流数据保存到内存中，然后根据用户操作对原始数据进行分析，该模块的实现主要在oject.cpp、Comand.cpp、MainDlg.cpp等文件中实现。拟合函数曲线的颜色；Value：反应池对应的参数（PPM浓度或者稀释浓度；StartTime：污染物加入时间；EndTime：测试结束时间DataList：数据列表。Test：反应池所属的测试：类CVesselLess用来对类CVessel列表进行排序；类CTest表示的是测试对象，包括以下组反应池有反应池)；Duration：测试最大持续时间；AutoStart:自动开始；AutoStop:自动停止；UsePPM:反应池对应的参数是PPM浓度，否则为稀释浓度；PA：拟合函数A的初始值；PB：拟合函数B的初始值；PC：拟合函数C的初始值；K：归一计算时的K值； 大枚举次数；Points[3]：Y轴单位像素（YPo）nts[0]＝>原始数据图、YDelta[3]YYMaxalue3]yY轴放大系数；YMaxScale[3]：y轴最大放大系数；XPoints[3]：X轴单位像素；XDelta[3]：X轴值增量；XMaxValue[3]：x轴最大值；XScale[3]：X轴放大系数；XMaxScale[3]：x轴最大放大系数；点连线等；FnColor：函数曲线颜色；PointColor：采样点颜色； 项目。类CTestLess用来对类CTest列表进行排序。类CProject表示的是测试对象，包括以下属性：Id：项目ID；Version：项目版本；列表。类CProjectLess用来对类CProject列表进行排序。数据是以文件的形式存放的。文件包括项目文件(.csp)和测试文（.cst名为Test的测试。则生成的文件 |————|————Project-数据CRC、其他标志。 二 图2.14数据结构数据处理方一般的正常毒性测试会有8个反应池同时进试，其中包括两个空白反应池以及6个呈一定毒性浓度或者（稀释）梯度的得到的数据将是这8组反应池电极记录的4060分钟的电流数据阵，如2.1所示2.11234567800………8第二步，数据归一处理及修用下述得出毒性物质相应的抑制率错误!未找 源 （式Im,nmnIm,0mIctrl,0k计算采用高斯－牛顿迭代法之初始值选定法软件系统使用说打开软序。程序显示界面如图2.15。建立新的端

图点击设置（）”，选择串口设置C，进行端口的选择（见界面图2.16。注：该仪器一共设有4个端口： 、 、 3和COM4，可以根据电脑的选择需要的端口建立新的测试项

图点击文件（F，在弹出的框中输入测试项目的名称等信（见界面图2.17。在弹出的框中，设置并保存测试项目建立新的测

图上述立的项下，置新测试，弹出测试设置2.18测试信息和指令。测试设

图在上述测试文档建立后，进试样电极的设置，点击设置（S）19，运

图2.20所示。计

图提示。总结

图软件采用Windows编程技术，编程工具为面向对象的Visual现自动提示，系统操作简单，人机界面友好。使用串口数据，XML保存数据和配置信息，便外部使用3重DES加密数据（加密可用户设置使用CRC进行数据校验，保证保存的数据的安全和可靠。使用大范围收敛的迭代法估算非线性回归的三个参数，然后生物传感器电极的开电极结为了降低成本，方便，利于批量生产，本项目采用丝网印刷电极基2-3、Ag/AgCl2-4和微生物固定点2-5组成，微生物固2-5部分用于固定指示微生物，Ag/AgCl2-4用作参比电极。2.22丝网印刷材料选油墨（表2.2）和银氯化银油墨（表2.3。本实验使用的方法是加热，由于采用的PC基材在下变形也不大，所以的温度均选择在100℃。银氯化银层使用100℃10分钟，绝缘层100℃7分钟，碳层使用100℃15分钟。参参PET14微米，150120℃约15min100/100（十字错纹胶带剥离试验2.3参>360℃30min室温20℃密封保存 电极丝网印制过丝网印刷第一步是好印刷的网框，网框相关的技术参数如2.4所示。采用丝网印刷机见图2.23。2.4感光胶厚度2.23印制丝网电极的具体步骤如下致印制时油墨无法均匀分布。台上定位，并面胶固定边界位置，以确保每一个基板的置都一致。一般新购置的基板表面有透明的薄膜保护，如果没有该保护膜要超声5分钟。然将基板都放入烘箱中，以100℃的温度烘烤半小时。如果不进行预热处理，之后固定第一块网框（碳层调节网框和工作台的距离，保持两者水平，一般以2到3mm45°为宜。然后将刮墨刀放（）10015并且回收多余的油墨，回墨刀，刮墨刀，网框，并准备第二个网框。第二个印制绝缘层，取已经好的基材固定在工作台上，重新调节刮墨刀和回墨刀的力开始试印，并且微调刮墨刀及回墨刀的力度完成后将网框放入烘箱，100℃烘7分钟所需的器材并且重复710步骤，进行最后银氯化银的印制。印制完成后将基板放入烘箱100摄氏度烘10分钟试验的丝网电极如图2.24：总结

2.24（1）采用丝网印刷技术，以导电碳墨为工作电极，AClg3、多通道微生物传感器的分析性能测试步该水质毒性分析用微生物传感器测定步骤：将的微生物电极放置于含质量浓度为0.85%NaCl的呼吸基质中活化30min，将经活化的微生物电极浸入装有10ml呼吸基质的平底玻璃瓶中，待微生物传感器毒性分析系统稳定5～10min后，加入一定量p-苯醌氧化还原介质（图3.1a处待电信号稳定约15min，加入不同浓度待测样品进行毒性测试（图3.1b处。此过程中，微生物传感器计算系统将自1图3.1微生物固定方法表3.1微生物固定方法性能比较见表表3.1

易难难易--佳-- 弱强窄--宽--低低低佳戊二醛－牛蛋白交联法能较好的实现微生物与传感器急性毒响应，该生物传感测的稳定不佳，存不海藻酸钙包埋法和聚乙烯醇凝胶包法的微生物容聚碳酸酯膜固定法是良好的微生物定方法，的微生因此，采用聚碳酸酯膜直接固定法，将有助于新型生物传感器开发和推广应用。微生物电极见图3.2图图3.2盐度对毒性分析的影实验选用的E.coli微生物传感器，了盐度对生物传感器后，在呼吸基质中投加不同浓度范围（0.5%～10%）的NaCl溶液，盐度对生物传感器电流信号的影响情况见图3.3。3.3可以看出，当分NaCl浓度低3%时，该微生物传感器的电流差异性较小，随着NaCl浓度高5％时，生物传感电流信号才有明显降低，表明在该盐度条件时，E.coli的呼吸活性开始受到明显的抑制作用。而盐度5%的水体，在一般的地表水中是3.3pH值对毒性分析的影以看出pH5.86时，传感器的电流信号开始有明显下降，表了该微生物传感器具有较宽的pH适用范围。事实上，在实际废水的毒性分析中，微生物传感器往往图 pH的影试验采用同批次E.coli微生物电极进行Cu2+的3批次平行毒性分析，试验结果如图3.5所示。从图3.5可以看出，基于该E.coli微生物电极的微生物传感器具有良好的重现性。 次平行试验所得出EC50值分别为3.1、3.8μg.mL-1，相对标准方差仅为0.35%，能很好地满足污染物急性毒图3.5微生物电极的长期保存微生物传感器电极的长期保存性能是影响其推广应用的主要因素而在细的保存过中，其活性谢的变化会生物传器的分析性能产生影响，有可能导致微生物敏感元件的活性有可能降将的.coli于4℃冰箱内，每隔段间取一电极于Cu23.6。图3.6E.coli2个月时仍然保持着良好的稳定性能，保存10、20、3060d供了良好的基础。总结采用p-苯醌为电子传递介质，实现对微生物电流信号的精操作简单。有效避免了环境因素如pH、盐度等的干扰，大大提高了毒性分析的采用聚碳酸酯膜直接固定法微电极，操作简单大大降低分析费用。在重金属毒性分析中的实验以枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）为指示微生物，探讨其不同培养周期的Bacillussubtilis对毒性分析性能的影用不同培养阶段的微生物的微生物传感器的毒性分析性能会有所不同。本试验取10、20和48h三个不同培养时间的Bacilussubtlis菌体，采用聚碳酸酯膜直接固定法acilussubtils微生物电极，分别用于Cu2Cu2对acilussubtls的活性抑制曲线如图37所示。抑制抑制率0 3.7BacillussubtilisCu2+3.7可以看出，Bacillussubtilis培养周期10h20h时制备的Cu2+的急性毒性响应较为接近，Bacillussubtilis重金属离子毒性Hg2+、Pb2+和Co2+等重金属离子急性毒性分析中的应用性能（见图由图3.8可以看出，基于Bacillussubtilis型微生物传感器对Cd2+、重金属离子的最低毒性检出限为0.05mg/L。计算得几种重金属离子Pb2+和Co2+对Bacillus 的毒性强弱顺序为Hg2+>Cu2+>Zn2+>Cr6+>Cd2+>Pb2+>Co2这与根据传统的细胞和 3.8Bacillussubtilis 表3.2几种重金属离子对Bacillussubtilis的EC50值 在有机物污染物毒性分析中的试验采Bacillussubtilis微生物传感器对2-NP、4-NP、2-CP、2,4-DCP、四环素和十二烷基苯磺酸钠等有机物的急性毒性进行分（图3.9）。由图3.9可以看出，随着几种有机物加入浓度的增加。测试得2-NP、4-NP、2-CP、2,4-DCP、四环素和十二烷基苯磺酸钠等121.3558.9mg/L，其对上述几种毒性有机污染物的最低毒性检出3.9Bacillussubtilis总结如发光菌等毒性分析方法菌株选择的局限性，毒性反映结果更真实。该新型微生物传感器，可筛选固定不同的毒性敏感菌株为步的筛选优化。与标准毒性分析方法的相关性发光细菌试验是环境样品毒性检测的生物测试技术，并已列入中国，即B/T154411995《水质急性毒性的测定发光细菌实验了本作品与发光细菌标准毒性分析方法的相关性其中：本作品仪器采用的指示菌株为大肠（E.ColiTop10发光菌法检测所使用的菌株为：费歇尔狐细菌（VibrioiNRRLB-11177分析仪器为毒性检测仪MicrotoxModel500综合毒性检测仪（试验Cu2+、Zn2+3,5-二氯酚等三种毒性物质为分析对象，两种分析方法的毒性分别见图3.10~3.12。3.10Cu2+3.10毒性分析结果可以看出，两种毒性测试方法对Cu2毒性3.11Zn2+Microtox的好，两种毒性测试方法对Zn2+的毒性分析结果的相关系数R2=0.9034。3.123,5-酚的毒性随浓度变化结果相近，分析得其对应的毒性相关系数上述研究表明，本作品发明的多通道微生物传感器毒性分析与发光菌标准的性分析法具良好的相关，为该器的广应用提供了良好的技术保障。现场应曲阳污水处理厂水质毒性2080年代初建设、采用常规活性污泥法、主要去除有机污染物（CODr）6万3d，处理厂出水达标后就近排入河道。 表3.3曲阳污水处理厂实际进水水 水质指 范 620 250TP/TN/NH3-N/动植物油/石油类/LAS/色度/大肠杆菌/个图 基于Bacillussubtilis的多通道生物传感器对曲阳污水厂污水的性分析结果见图3.143.153.14图3.153.14和3.15可以看出，曲阳污水厂的生活污水对acilusSubtls的活性抑制作用不明显，100acilusSubtls的抑制19%（与基于发光菌毒性分析结果（21%）相一致。实际上，表3.3该进水经过A2O活性污泥处理工艺处理后，出水的水质综合毒性好的生物安全性。黄浦江水质毒性黄浦江上是最主的饮用地，占全原水取量0，是生态环重点保区域，旦江上生突发性学品泄事故，市的饮水安全受到。尽定和出台系列受到各种污染的威协，其中化泄漏的污染风险更大。3.16见图317和.1.图3.17图3.18分析结果与基于发光菌的毒性（6~8%）相一致。同济大学三好坞水质毒性检见图319和.2。图3.19图3.20图3.21分析结果与基于发光菌