植物细胞培养ppt课件

1、.,第四章植物组织与细胞培养,4.1植物组织培养与细胞培养的区别4.2发展历史4.3植物组织与器官培养4.4植物细胞培养4.5植物原生质培养,.,4.1植物组织培养与细胞培养的区别植物组织培养：指取出机体内组织与细胞，模拟机体内生理条件，使之在体外生长成组织或完整植株。植物细胞培养：植物细胞在体外条件下的存活或生长，不再形成组织，以生产次生代谢产物为目的。,意义：能够有效地保持优良品种的特性；生产无病毒种苗，快速繁殖新品种；生成药物成分如紫杉醇等,.,4.1植物组织培养与细胞培养的区别4.2发展历史4.3植物组织与器官培养4.4植物细胞培养4.5植物原生质培养,.,4.2发展历史和研究意义：,

2、4.2.1发展历史：自学4.2.2研究意义：具有重要的经济意义,.,4.1植物组织培养与细胞培养的区别4.2发展历史4.3植物组织与器官培养4.4植物细胞培养4.5植物原生质培养,.,4.3植物组织与器官培养,4.3.1植物组织培养的定义：在无菌条件下，将离体的植物器官，组织，细胞，胚胎，原生质体等在人工培养的条件下，诱发产生愈伤组织，潜在芽或者长成新的完整植物的一门实验技术，又称为“试管植物”。,.,4.3.2几个重要概念,全能性细胞：是能够表达生物体基因组的任何一种基因，并能分化出该生物体内任何一种类型的细胞，进而发育为一个完全相同的生物体。外植体：用来进行离体无菌培养的离体材料。愈伤组织

3、：外植体在离体培养条件下，细胞经脱分化等一系列过程，产生一团不定型的疏散排列的薄壁细胞（具有未分化细胞的特性）。胚状体：由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽，胚根和胚轴的胚状结构。不定芽：愈伤组织中的细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。,.,4.3.3植物组织培养的基本步骤,培养材料的采集培养材料的消毒制备外植体愈伤组织形成根和芽的诱导组培苗的练苗移栽,基本步骤,.,试管植物的两个核心步骤：一是愈伤组织的形成，二是愈伤组织的分化,愈伤组织的形成,愈伤组织的分化,.,1）培养材料的采集：,可以取受精卵，发育中的分生组织（根尖，茎尖），雌雄配子等。最常用的培养材料是茎尖，通常切块0.5

4、cm以下，如果是培养无病毒苗，其长度在0.1mm以下。,.,外植体（培养材料）选择的原则,必须含有活细胞。幼嫩组织所含活跃分裂的细胞比例高。母株必须健康并且无任何腐烂或生病的迹象。母株必须活跃生长并且不会立即进入休眠。,总的原则：健康无病的年幼组织。,.,2）培养材料的消毒,.,3）制备外植体,在无菌条件下将材料切成0.2-0.5cm厚的小片，剥去芽的鳞片，嫩枝的外皮或种皮胚乳。,.,4）接种和培养（愈伤组织的形成，生长和分化）,接种：无菌环境下，外植体接种在培养基上，每瓶接种4-10个。,.,培养基的主要成分：水无机成分：无机大量元素氮：铵盐、硝酸盐混合磷：磷酸盐钾：钾盐钙、硫、镁无机微量元

5、素主要有：铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴、氯有机成分（碳源）：糖、维生素、肌醇、氨基酸及有机附加物。植物生长调节物质：生长素类：NAA、IAA、IBA、2,4-D细胞分裂素类：BAP,KT，TDz，ZTpH值（5.8）琼脂,.,封口：接种后，瓶，管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口温度（25度），pH（5-6）和氧气（5%）增殖：在新梢（愈伤组织）等形成后，分株或切段转入增殖培养基中继代培养。,.,5）愈伤组织的生成,成熟细胞经脱分化等一系列过程，产生一团不定型的疏散排列的薄壁细胞-愈伤组织。植物愈伤组织的芽和根的分化由生长素和细胞分裂素的浓度及比例决定的。当生长素浓度大于细胞分裂素浓度时，

6、愈伤组织分化根，反之则形成芽。,.,6）组培苗的练苗移栽,试管苗进入自然环境前必须进行练苗。将培养容器打开，自然光照3天，取出小苗后用自来水冲洗干净；再移栽到准备好的基质中。,.,4.3.4愈伤组织的形成过程,在接种和培养的过程中涉及到愈伤组织的形成，生长和分化。愈伤组织形成一般要经过三个步骤：,.,1）启动期：指成熟细胞或原生质准备分裂和脱分化的时期，需要合适的诱导剂：NAA，IAA等。2）分裂期：外植体细胞经过诱导以后脱分化，外层细胞，不断分裂、增生子细胞的过程。3）分化期：分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。分化出形

7、态和功能不同的细胞，分生细胞、色素细胞、纤维细胞等。,.,愈伤组织要求：松散性好、增殖快、再生能力强。外观一般为鲜艳的乳白或淡黄色，呈小颗粒状，疏松易碎。,.,诱导愈伤组织形成的条件：,植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素：包括生长素（NAA，IAA，2，4-D）和分裂素（KT，6-BA，ZT）：生长素使用浓度一般在0.01-10mg/L，分裂素使用浓度一般在0.1-10mg/L其他一些条件：植物生长力、来源、培养基的种类、培养条件等。,.,幼苗茎尖,消毒处理,接种培养形成愈伤组织,MS+（1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA,继代培养,生芽培养,MS+（2-4m

8、g/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA,生根培养,MS+(0.1-0.5mg/L)IBA+（2-5mg/L)PP333,基质：河砂珍珠岩（11）,炼苗,炼苗移植,芦荟的愈伤组织培养,.,4.3.5植物器官培养,定义：指将植株上的各种器官从母体上分离出来，放在无菌的人工环境让其进一步发育，最终长成幼苗的过程。植物器官主要包括：毛状根，芽，体细胞胚等植物器官培养技术与植物组织培养技术基本一致。,.,4.3.6植物组织培养的应用：,1.无性繁殖系快速繁殖2.获得无病毒植株3.新品种育种4.在遗传、生理、生化和病理研究上的应用5.种质资源保存与创新6.产业化生产：花卉，果蔬脱毒,.,4.3.7

9、人工种子,在一定条件下，愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽，胚根和胚轴的胚状结构胚状体定义:即最外面包裹一层有机薄膜的植物胚状体,优势：便于运输和储藏；提高生产效率；保存珍贵品种,.,人工种子,外层：固定化膜（有机薄膜），保护胚状体水分，防止外部力量冲击中间：营养成分和植物激素内层：包裹的胚状体或芽,.,4.1植物组织培养与细胞培养的区别4.2发展历史4.3植物组织与器官培养4.4植物细胞培养4.5植物原生质培养,.,4.4植物细胞的培养：,4.4.1植物细胞培养定义定义：指在离体条件下，将愈伤组织或其它容易分散的组织置于培养基中进行培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得

10、大量细胞群体的一门技术。目的是获得初级和次级代谢产物。可通过改变培养基成分及其浓度，生长调节剂的选择等手段来实现代谢产物的诱导。,.,4.4.2植物细胞培养的方法,根据培养对象：主要有：单细胞培养，单倍体培养（花药雄性生殖细胞），原生质根据培养系统：主要有：固体培养和液体培养。,.,4.4.3植物细胞培养的培养基,基础培养基有：MS，B5，N6。主要有无机盐，碳源，有机氮源，有机酸等构成。常用的培养基的组成：MS+植物生长激素+椰子汁,.,4.4.4植物单细胞培养,单细胞培养目的主要是观察培养的细胞个体是如何进行分裂，分化，生长及发育，同时也为大规模培养奠定基础。单细胞培养的过程中往往也涉及愈

11、伤组织的形成.,.,4.4.4.1单细胞制备方法：,机械法：机械磨碎；效率低酶解法：消化植物细胞壁的专一性水解酶如：纤维素酶，效率高来源于愈伤组织,.,4.4.4.2单细胞培养,平板培养看护培养微室培养双层滤纸培养悬浮培养,适宜于得到的细胞数目少，细胞比较珍贵的情况下使用,.,1)细胞平板培养,平板培养（platingculture)是指将一定密度的悬浮细胞接种到或混合到一薄层固体培养基中培养的技术,类似于微生物细胞的平板培养。细胞的分离及密度的调整：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，要选择合适的过滤网筛。细胞密度一般控制在1000-1105/ml,.,板的制备和细胞的培养：35的固

12、体培养基（1.4%琼脂）均匀的平铺于培养皿中，厚度5mm左右。接种和培养：26置暗处培养21天。低倍显微镜观察，记数单细胞或小细胞团，计算置板效率（也称植板率）。植板率:已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）,.,固体平板培养图示：,优点:可以定点观察分离细胞容易缺点:培养细胞气体交换不畅，湿度不够。,.,2）看护培养和饲养层培养,I看护培养（nurseculture）Muir等1953年设计。是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖。,.,定义:指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。基本技术:（1）在一个培

13、养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。（2）在无菌条件下，将一小块活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片已灭菌的滤纸，放置一晚上。（3）将分离的单细胞接种到培养基的滤纸上。（4）恒温培养1-3月。,.,优点：（1）简便易行。（2）效果好，易于成功。缺点：（1）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。,看护培养特点：,.,II饲养层培养：,饲养层培养是用处理过的（X射线处理）无活性的或分裂很慢，不具备分裂能力的细胞来饲养所养的靶细胞(要培养的细胞）。,红色的细胞为饲养层细胞；蓝色的为靶细胞,.,3）双层滤纸培养在饲养层和靶细胞层之间放两张滤纸,上面一层滤纸用于将靶细胞转移到

14、其他培养基上继续培养.,.,4）微室培养,定义:将单细胞培养在少量的培养基中培养。,.,优点：（1）在培养过程中，可以连续进行显微观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程.缺点：（1）培养时间较短.（2）操作麻烦。,.,5)悬浮培养,将一定密度的悬浮细胞接种于液体培养基中,在保持良好的分散状态下培养.适宜于消化得到的细胞数充足的情况下使用。,悬浮培养,.,4.4.4.3细胞的同步化,细胞同步化：指同一培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。有饥饿法，抑制法和冷处理法等。,.,可以通过饥饿法获得G1或G2期同步化细胞。,.,.,.,有丝分裂抑制法:在指数生长期的细胞悬浮培养物加

15、入一定浓度的有丝分裂抑制剂如秋水仙素4-6小时，作用不可逆的。,.,4.4.4.4植物细胞的保存,继代培养保存法低温保存法：5-10度冰冻保存法：-20度或液氮中,.,4.5原生质体培养,原生质体的相关的概念和研究意义原生质体的分离原生质体培养,.,4.5.1关于原生质体的几个重要概念,原生质体(protoplast):指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体（subprotoplast）：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。,.,4.5.2原生质体研究意义,研究组织和器官发育机制；可以进

16、行有关遗传操作；研究植物细胞的生理功能；诱导融合形成杂种细胞。,.,4.5.3原生质体的制备,原材料准备,预处理与酶解,原生质体收集与纯化,原生质体活力检测,.,4.5.3.1用于分离原生质体的材料来源,两个来源：,各种组织的叶片，根尖等,愈伤组织,.,4.5.3.2酶消化,取材消毒取植物组织，消毒后去掉表皮，剪碎；酶消化然后在25-28度水浴酶解60-90分钟。使用的酶：果胶酶，纤维素酶等,.,4.5.3.3收集和纯化原生质体,酶解结束后,要将原生质与碎片和酶液分离，然后经洗涤后再进行培养.过滤-离心法：先过滤后低速离心沉淀漂浮法：利用原生质体比重小，能在25%的蔗糖溶液中漂浮沉降法和漂浮法

17、结合.先离心收集沉淀，在用21%蔗糖漂浮离心,.,4.5.3.4原生质体鉴定及活力检测,鉴定：低渗胀破法和荧光染色法,.,荧光染色法：在活细胞内，FDA（二乙酸荧光素）被酯酶裂解即发荧光（荧光素）,活力测定,.,影响原生质体活力的因素,分离材料的生理状态酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压分离条件：高心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响,.,液体浅层培养；固液双层培养，固体平板培养，琼脂糖珠培养，看护培养，饲养层培养。,4.5.4原生质体培养,.,4.5.5愈伤组织形成与植株再生,细胞分裂与细胞壁再生在短时间内细胞壁和叶绿体开始

18、生成；细胞开始分裂。愈伤组织形成愈伤组织分化根据需要可进行植株再生或细胞的大规模培养,.,4.5植物细胞和组织的大规模培养,植物中含有数量极为可观的次代谢物质。这些次级代谢产物对人类有巨大的利用价值，如紫草细胞中的紫草宁可用于治疗创伤，烧伤；人参是治疗与保健的名贵药材。,依靠传统从植物中分离提取已很难满足需求，工业化生产植物产品是一条有效的途径。,.,植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较,.,4.5.1植物细胞大规模培养的特点,植物细胞的特点（与微生物比较）：体积大以细胞团的形式存在对剪切力敏感生长慢，周期长对营养要求高培养过程中容易产生泡沫,.,4.5.2培养植物细胞的生物反应器,要取得植物细胞大规模培养的成功，生物反应器是其关键因素：生物反应器的设计与选择：性能要好；生产效率要高；价格要便宜。,.,4.5.2.1生物反应器培养方式：,分批培养：一次性添加培养液和细胞半连续培养：每隔一段时间加培养液和收集培养物连续培养：连续加培养液和收集培养物。,.,4.5.2.2植物细胞大规模培养方式：,机械搅拌悬浮培养非机械搅拌填充床反应器固定化细胞培养流化床反应器,.,1）搅拌式生物反应器