杜仲叶中绿原酸的提取纯化研究

江苏技术师范学院化学与环境工程学院学院（系、部）： 实验课程名称 ： 论 文 班 级 名 称 ： 学 生 姓 名 ： 学 生 学 号 ： 指 导 老 师 ： 作 业 时 间 ： 江苏技术师范学院化学与环境工程学院1目 录1. 材料与方法 .41.1 材料与仪器 .41.2 提取纯化工艺 .41.3 绿原酸的含量 .42. 结果 .42.1 提取条件 .42.1.1 提取溶剂的选择 .42.1.2 提取温度的选择 .52.1.3 提取时间的影响 .52.1.4 浸提液 pH 值的影响 .52.2 絮凝脱色 .52.3 大孔吸附树脂的选择 .52.4 NKA-9 树脂对绿原酸的吸附实验 .62.4.1 绘制动态吸附曲线 .62.4.2 进样液流速对吸附的影响 .72.4.3 进样液 pH 值对吸附的影响 .82.5 NKA-9 树脂对绿原酸的脱附实验 .82.5.1 进样液 pH 值对吸附的影响 .82.5.2 绘制其洗脱曲线 .92.6 重结晶 .103 结论 .103.1 物理性状 .103.2 化学结构 .11参考文献 .122杜仲叶中绿原酸的提取分离作者：袁华，邓良，杨小俊，闫志国 ，吴元欣【摘要】 目的研究杜仲叶中绿原酸的提取纯化方法。方法采用水提、絮凝脱色、树脂吸附、重结晶工艺提取纯化。结果杜仲叶的水浸提液浓缩后用 1%壳聚糖絮凝去杂、活性碳脱色得到进样液，进样液用 NKA-9 树脂吸附，50%乙醇解吸，洗脱液浓缩后的粗品经甲醇重结晶得到纯度97%的绿原酸，提取率65%。结论 优化完善了杜仲叶中绿原酸的提取纯化方法，为杜仲资源的充分综合利用和产业化开发提供了参考。【关键字】 绿原酸； 提取； 纯化； 杜仲叶Study on the Extraction and Purification of Chlorogenic Acid in Eucommia ulmoides Oliv. LeavesAbstract ：Objective To study the optimum extraction and purification process for chlorogenic acid in Eucommia ulmoides Oliv. Leaves. MethodsThe process was carried out by water extraction, 1% chitosan flocculation, actived char decolorization, NKA9 resin adsorption, 50% ethanol desorption and methanol recrystallization. ResultsThe extracting ratio of chlorogenic acid was 68% with purity of 97%.ConclusionAn optimum and improved technology for the extraction and purification of chlorogenic acid in Eucommia ulmoides Oliv. Leaves was investigated. It is helpful to industrial production of chlorogenic acid.Key words：Chlorogenic acid; Extraction; Purification; Eucommia ulmoides Oliv.杜仲 Eucommia ulmoides Oliv.是我国特有的经济树种，其药用价值历来受到人们关注。杜仲中主要有效成分绿原酸具有抗菌、抗病毒、利胆、保肝、降压、清除自由基等作用。2000 多年前我国的神农本草经就将之列为中药上品。近年来研究表明杜仲叶中的主要化学成分和杜仲皮基本一致，且杜仲叶中绿原酸含量更为丰富，达到干叶重的 1%5%，因此从原材料丰富且价廉的杜仲叶中提取绿原酸成为研究热点13。其中钱骅4、刘军海等5提出的大孔吸附树脂江苏技术师范学院化学与环境工程学院3提取纯化法展示了一定的工业化前景，但报道的树脂分离效果不一致，且均未见有关终产品纯度及收率的报道。杜仲叶提取物中除含绿原酸外，还含有鞣质、蛋白质、多糖等物质。为了得到纯度较高的绿原酸，必须对提取液进行多步分离纯化。本文在文献工作的基础上，围绕产业化目标，改进完善了提取制备工艺，采用水提、絮凝脱色、树脂吸附、重结晶工艺提取制备了纯度与收率较高的绿原酸。1. 材料与方法1.1 材料与仪器杜仲叶采自湖北五峰（风干、粉碎）；主要试剂乙醇、甲醇、稀盐酸等均为分析纯；壳聚糖为生化试剂；NKA9，AB8，NKA型树脂(南开大学化工厂)；绿原酸（中国药品生物制品检定所）。ZF型紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；Agilent 1100 型高效液相色谱仪。1.2 提取纯化工艺准确称取 10.0 g 杜仲叶，用去离子水 2120 ml 在 80下动态提取 150 min，过滤,提取液减压浓缩至 100 ml，浓缩液中加入 1%壳聚糖溶液 4 ml 絮凝，过滤，滤液用活性碳脱色，得进样清液，用 NKA9 树脂吸附进样清液，用 50%乙醇溶液洗脱，洗脱液减压浓缩，得绿原酸粗品，经甲醇重结晶得绿原酸纯品。提取率65%（以杜仲叶中绿原酸含量计），纯度97%。1.3 绿原酸的含量检测绿原酸的含量测定参照文献6，7进行。42. 结果2.1 提取条件2.1.1 提取溶剂的选择杜仲叶中绿原酸的提取一般选用 40%乙醇水溶液，使用乙醇水溶液提取除增加溶剂成本以外，提取液中的脂溶性成分增加，造成后续处理困难，绿原酸在热水中溶解度较大，本文选用水为提取溶剂。2.1.2 提取温度的选择随着提取温度的升高，绿原酸得率不断增加，当温度高于 80时，绿原酸得率开始下降。随着温度的升高，杜仲叶中其它成分的溶出也不断增加，同时考虑到绿原酸的热不稳定性，提取温度控制在 80以下。2.1.3 提取时间的影响提取的时间随着时间的延长，绿原酸得率逐渐升高，尤其是在 50150 min 内，二者几乎呈现良好的线性关系，随后逐渐达到提取平衡状态。2.1.4 浸提液 pH 值的影响在温度、料液比、提取时间一致的条件下，用稀盐酸调节提取溶剂的 pH 值，当 pH 值为 4 时，绿原酸得率较高。因此，绿原酸的最佳提取工艺条件为：每10.0 g 杜仲叶，用 2120 ml 去离子水在 pH=4 及温度 80下动态提取 150 min。2.2 絮凝脱色传统中药提取工艺中常常采用水提醇沉法，目的是除去提取液中的淀粉、树胶、蛋白质、粘液质、果胶、多糖、无机盐等无效成分。实验发现，水提醇沉法中醇的浓度越高越有利于除去杂质，但有效成分由于醇沉包夹损失也随之增大。另外水提醇沉工艺还存在乙醇消耗量大、生产成本高、生产安全系数低等缺点，因此需要改进工艺。絮凝澄清法是在中药提取液或提取浓缩液中加入一种絮凝剂以吸附架桥及电中和方式除去溶液中的某些物质，以达到分离纯化的目的8。实验通过絮凝剂种类、浓度及絮凝温度、酸度的选择比较，确定江苏技术师范学院化学与环境工程学院5优化的絮凝脱色工艺为：每 100 ml 浓缩液中加入 1%壳聚糖溶液 4 ml，搅拌，在 60静置 60 min，过滤，滤液用 1g 活性碳脱色，得进样清液。2.3 大孔吸附树脂的选择结合杜仲叶浸提物的特性，本文对 NKA-9，AB-8，NKA-3 种极性的大孔吸附树脂进行选择比较。树脂根据文献4，5经预处理、再生后，进行静态吸附与解吸实验，3 种不同型号的大孔吸附树脂对绿原酸溶液（4.8 mg ml-1，10 ml）得到的吸附量、吸附率和解吸率如表 1 所示。表 1 3 种树脂对绿原酸的吸附和解吸情况由表 1 知，3 种大孔吸附树脂对绿原酸均具有较高的吸附量和吸附率，但是 AB-8 型树脂吸附的绿原酸很难被解吸下来，不宜用作分离绿原酸的树脂，只有 NKA-9，NKA-型树脂较为适合。比较可知，NKA-9 型树脂在静态吸附时具有较高的吸附量和吸附率，而且易解吸，2.4 NKA-9 树脂对绿原酸的吸附实验2.4.1 绘制动态吸附曲线将浓度为 3.0 mg ml-1 的绿原酸溶液加入装有 200gNKA-9 型大孔树脂的玻璃层析柱中，在流速为 2.0 ml min-1 时（可用 BV/h 表示，即每小时流过床层的流动相的体积为树脂床体积 Bed Volume 的倍数), 测定流出液中绿原酸的浓6度，绘制吸附曲线（见图 1）。结果表明，该树脂可处理 78 倍树脂床体积的进样液。图表 1NKA-9 树脂对绿原酸的吸附曲线2.4.2 进样液流速对吸附的影响为了进行有效的吸附，在树脂吸附过程中有必要使固液两相有充分的接触时间。进样流速过大，树脂对绿原酸来不及吸附，导致吸附率下降；进样流速过小，虽然吸附较充分，但是吸附时间长，效率较低。将浓度为 3.0 mg ml-1的绿原酸溶液过柱，考察单位时间内树脂的吸附量与不同进样流速的关系，结果表明，在流速为 2.0 ml min-1 时，吸附效果最好。见图 2。图表 2 进样液流速对吸附的影响江苏技术师范学院化学与环境工程学院72.4.3 进样液 pH 值对吸附的影响在不同 pH 值下进行吸附实验, 结果表明，绿原酸作为多羟基酚酸，在酸性条件下易被吸附。因为在酸性条件下，绿原酸以分子形式存在，树脂对其吸附作用增强；在强酸条件下，以内酯形式存在的绿原酸容易水解；在碱性条件下，以离子形式存在的绿原酸则不易被吸附。由图 3 可知，pH 值为 3 时，吸附效果最好。图表 3 进样液 pH 值对吸附的影响82.5 NKA-9 树脂对绿原酸的脱附实验2.5.1 进样液 pH 值对吸附的影响洗脱液的选择化合物经树脂吸附后，根据吸附力的强弱不同而选用不同的洗脱剂。一般来说，吸附剂与吸附质以分子间色散力作用时，吸附力较弱，易于洗脱；而当吸附剂与吸附质以偶极间作用力或氢键作用时，吸附力强，不易于洗脱。NKA-9 大孔树脂极性较强，同时绿原酸是含有酚羟基化合物，容易与树脂形成氢键，对绿原