猪苓多糖的提取研究工艺

：猪苓多糖分离提取工艺研究11 前 言1.1猪苓形态概述猪苓( Polyporusumbellatus ( Pers. ) Fr .), 又名猪屎苓、地乌桃、猪茯苓、猪灵芝.属于无褶菌目( Aphyllophorales)多孔菌科( Pohyporaceae ) 多孔菌属( Polyp or us) 1 , 猪苓的生长发育要经过担孢子、菌丝体、菌核和子实体四个阶段。担孢子成熟后从菌管中发射出来，遇到适宜的条件会萌发成菌丝（初生菌丝），然后在菌丝细胞内形成简单的横膈膜，多隔菌丝经锁状联合后形成双核菌丝，菌丝不断生长，生长到一定数量时交叉纠结成菌核 2。菌核能贮存营养，环境不适时休眠，环境适宜或遇到蜜环菌就能萌生菌丝。每年春天，地温升高到约10，土壤含水量在3050时，菌核便开始萌发。菌丝突破菌核表皮，不断增多形成菌球，进而长成白苓。随着夏季地温不断升高，白苓生长速度加快，并产生许多新分支。秋天地温降低，生长速度渐慢，白苓表皮颜色加深，在越冬后颜色变黄或灰黄色，即成“灰苓”。灰苓再经过一个冬季后会变成黑色，即“黑苓”。只要条件适宜，一年中的春、夏、秋三季，母苓上随时可以萌发出新生白苓 3。所以，白苓、灰苓和黑苓实际上为生长年限不同(当年、次年、第三年)的猪苓菌核 4。邢晓科等对猪苓菌核进行显微观察时，发现菌核分为表皮和髓质，髓质菌丝相互黏连、紧密交织而成，菌丝中还存在含晶细胞。郭顺星等研究发现菌核表皮由几层菌丝紧密排列而成，细胞壁加厚，细胞趋于木质化，主要起保持水分和防止有害微生物侵染的作用 5。猪苓菌核在我国已有2 000 多年的用药历史, 其性平味甘,本草纲目有“开腠理，治淋肿，脚气,白浊带下，小便不利”的功效。生长在山林中柞树、枫树、桦树、槭树、橡树的根上，性喜松软凸起不易长草的土壤中，雨季常在凸起处生有一茎多头蘑菇状的子实体。夏秋条件适宜时，子实体从接近地表的菌核顶端长出 6。子实体很大，肉质、有柄、多分枝、末端生圆形白色至浅褐色菌盖，一丛直径可达35cm。菌盖圆形，中部下凹近漏斗形，边缘内卷，被深色细鳞片，宽14cm。菌肉白色，孔面白色，干后草黄色 7。孔口圆形或破裂呈不规则齿状，延生，平均每毫米2-4个。子实体幼嫩时可食用，味道十分鲜 美 8。本科毕业论文（设计）21.2猪苓菌体生长环境及地理分布猪苓菌丝在 5C35C范围内均可生长，当温度低于15C18C时，菌丝生长速度减慢，长势一般。菌丝褐变缓慢或暂无褐变，当温度高于 28C30C时，菌丝生长速度也出现减慢，长势变差，并易出现老化变褐,在 5C以下或 35C以上菌丝生长几乎停滞.猪苓菌丝生长的适宜温度为24C，最适温度为 25C 9。在黑暗和光照条件下，猪苓菌丝均可生长。在全黑暗下菌丝生长快，长势好。全光照或 12h 光暗交替，菌丝生长较慢，且易出现褐变老化 10。猪苓的分布很广，北起黑龙江，南至云南，西可到达青海,主产于陕西、云南、山西、河南、甘肃、四川等地，以云南的产量最大，陕西的质量最佳 11。在国外，日本是除中国外研究猪苓较多的国家，另外，欧洲和北美洲国家也有猪苓的分布。野生猪苓多分布于海拔l0002000m的山区，以l300l800m半阴半阳坡地的次生林中居多 12。生长坡度高度多在200500m，通常分布不规律，若坡度过大，常呈直线或斜线分布 13。猪苓菌核的埋藏深度一般在40cm及以上，会因雨水冲刷或少量枝叶覆盖而露头，故称“十苓九露头”。1.3猪苓多糖的医学效果猪苓主要药效成分是猪苓多糖. 可从猪苓菌丝和菌核中提取。多糖又称多聚糖，是由单糖缩合成的多聚物，它是生物体内除蛋白质和核酸以外的又一类重要的信息分子。广泛存在于植物、动物和微生物组织中。现有资料表明，多糖具有抗感染、免疫促进、肿瘤防治、病毒性肝炎、类风湿症、艾滋病等免疫损伤或免疫缺损症和抗氧化等多方面功能和生物活性 14。研究表明, 猪苓多糖是由B-1y3, B-1y 4 和B-1 y 6 葡萄糖苷键缩合而成的葡聚糖, 平均分子质量为10 000 70 000。猪苓多糖中含有大量的微量元素，微量元素是人体所需营养成分中的重要组成部分，是生命体消化过程中能量转换和组织构成的重要因素，例如铁是构成血红蛋白、肌红蛋白的必需成分，锌是人体多种酶的激活剂，参与唾液蛋白、视紫质的合成，是调节核糖核酸聚合酶的必须组成部分 15。猪苓多糖能显著降低肝脏中氧化脂质的含量, 清除自由基损伤, 提高细胞中超氧化物歧化酶和肝脏过氧化氢酶的活力, 对延缓组织细胞老化、保护机体抗老防衰十分有益具有解毒利水渗湿、抑制肿瘤、增强免疫力、保护肝脏、抗衰老、抗辐射等功效 16。临床上猪苓多糖用于原发性肺癌、肝癌、子宫颈癌、鼻咽癌、食道癌和白血病等放化疗的辅助治疗,同时临床也可减轻化疗的某些不良反应 17。1.4猪苓多糖的研究动态目前, 提取猪苓菌核胞内多糖的常用方法是热水煎煮法。近年来, 随着多糖浸提新技术的发展,研究者还发现, 超声波、微波、酶解等辅助处理技术, 也能卓有成效地促进胞内多糖的浸出。利用液体发酵技术生产猪苓菌丝,并从猪苓菌丝中提取多糖是一种较新：猪苓多糖分离提取工艺研究3的研究技术 18。而且国内外有关以猪苓菌丝干粉为材料的多糖提取工艺研究尚比较少。本试验采用热水浸提法浸提菌丝体多糖。利用单因素水平对照试验, 分试验分别对影响猪苓液体发酵干菌丝多糖得率的主要因素进行进一步探索。2 材料与方法2.1 供试菌种原料采用山西农大植物病理实验室提供的猪苓菌种。2.2 仪器与试剂2.2.1仪器HVE-灭菌锅、GSP-9270MBE恒温培养箱、ZD-85A数显气浴恒温振动器、8002型温度控制仪2.2.2试剂无水乙醇, HCI, NaOH, 正丁醇, 95%乙醇, 氯仿, 硝酸银, 氨水等。2.3 培养基配制猪苓母种培养基:马铃薯（200g）,葡萄糖（20g）,琼脂粉(15g),酵母粉(10g)，蛋白胨 (6g)， KH 2PO4 (5.0g), MgSO47H2O（3.0g）,VB1（0.lg）液体培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g ,酵母粉10g，蛋白胨6g， KH 2PO4 5.0g, MgSO47H2O 3.0g, VB1 0.lg2.4菌种繁殖 从供试猪苓母种中用挑针挑取菌落边缘健壮的菌丝接种到猪苓母种的平板培养基上，在25.5C培养15d备用。2.5液体培养将菌落边缘新生菌丝切下0.5cm 2 的菌块,接种于猪苓液体培养基中 使菌丝体向上悬浮于液面, 置于25C恒温培养箱中静置培养48h。后在160r/min、25C恒温的条件下振荡培养25d。2.6 猪苓多糖生产工艺斜面菌种液体发酵过滤猪苓菌丝体低温干燥粉碎浸提浓缩乙醇沉淀粗多糖2.7猪苓菌丝多糖的提取方法本试验采用热水浸提法浸提菌丝体多糖。试验方案设计见表1。利用单因素水平对照试验, 分7 组试验分别对影响猪苓液体发酵干菌丝多糖得率的主要因素: 菌粉粉碎颗粒大小、浸提加水倍数、浸提时间、浸提温度、pH值、浸提次数、浓缩比例进行优化选择, 每组本科毕业论文（设计）4只改变一种条件, 其他按照多糖浸提基本方法进行。将浸提液浓缩后,用95%乙醇做沉淀剂,沉淀12h。浓缩液与乙醇倍数设计见表1。将沉淀物离心后,经干燥,得粗多糖。表1 多 糖 浸 提 条 件 的 优 选 实 验 方 案Table1 polysaccharide extraction conditions optimization experiment scheme项目 1 2 3 4 5 6干菌粉粉碎颗粒（目） 100 150 200 250 300 浸提加水倍数 20 25 30 35 40 浸提温度（） 70 75 80 85 90 95PH值 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0浸提时间（h） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5浸提次数 1 2 3 4 乙醇沉淀剂倍数 1 2 3 4 5 2.8 多糖测定方法采用苯酚硫酸法绘制标准曲线：精确称取经干燥的标准葡萄糖500mg，用500mL 蒸馏水定容，分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 至试管中，各以蒸馏水补至5 mL，然后加入5%苯酚水溶液1.0 mL，摇匀，在冰水浴迅速加入浓硫酸5.0 mL，溶液线呈现橙黄色，摇匀后呈橙红色，放置5 min 后，置沸水浴10 min，颜色由橙红色变为橙黄色，完全冷却后在波长490 nm处测定吸光度，以蒸馏水做空白对照。得标准曲线为：测定葡萄糖标准曲线的回归方程为：Y=5.621 8x+0.028 2，R2=0.998 2。式中：Y 为在490 nm 波长测定的吸光度；X 为葡萄糖浓度，（mg/mL）。2.9多糖的鉴别2.9.1 纸层析用毛细管吸取粗品水溶液, 点于新华层析纸上, 用正丁醇无水乙醇水( 3.533) 展开,以氨制硝酸银试剂( 0.1N 硝酸银与5N 氨水11 混合液) 喷雾, 于120烘烤510min, 显褐色斑示多糖位置。2.9.2 多糖确证实验 取粗品水溶液10mL, 加入过量的碱性酒石铜试液, 加温煮沸2min, 将产生的红色沉淀滤除, 滤液仍保持蓝色。取此滤液用硫酸酸化, 加温煮沸水解10min 后, 用10%氢氧化钠溶液中和, 再加入适量碱性酒石酸铜试剂, 加温煮沸,产生砖红色氧化亚铜沉淀。以上结果表明: 粗品除含多糖外, 尚含蛋白质杂质。3 结果与分析3.1 猪苓液体发酵干菌丝体粉碎颗粒大小对多糖得率的影响分别将猪苓液体发酵干菌粉粉碎加工为100目、150 目、200 目、250 目、300 目不同粒度的菌粉, 进行多糖浸提试验。从表3 可以看出菌粉粒度大小对多糖得率的影响, ：猪苓多糖分离提取工艺研究5当菌粉颗粒大小达200 目时, 多糖得率最高, 菌粉粒度越小多糖得率反而下降, 这是因为粒度太大, 不利于多糖完全溶解出来, 但是粒度太小, 菌粉易在水溶液里形成水包粉颗粒, 与溶剂不能很好的结合, 水溶性多糖也不利于溶出。因此, 选择200 目作为提取多糖的最佳菌粉粒度大小。3.2 猪苓液体发酵干菌丝体和水分比例对多糖得率的影响从表2可以看出加水比是影响多糖得率的主要因素之一。当加水比达301时, 多糖得率达最高, 继续增加加水量, 多糖的得率反而有所下降, 这是因为加水过多时溶液中糖浓度过低, 不利于析出, 同时若加水比过高, 沉淀多糖时还需要浓缩, 否则沉淀试剂乙醇的用量需要大幅度增加, 使原料消耗增加, 不利于实际生产。因此, 从节省原料和简化工艺等方面考虑, 选择加水比为301, 即加菌丝量的30 倍的水浸提多糖。分别按加水比为201、251、301、351、301、351、401 向已知质量的干菌丝粉中加入蒸馏水, 温水浴浸提多糖。表2 猪苓液体发酵干菌丝体粉碎颗粒大小、菌粉和水分比例对多糖得率的影响Table 2 liquid fermented grifola dry mycelium crushing particle size, the fungus powder and water ratio affect the yield of polysaccharide from菌丝体粉碎粒度（目） 多糖得率（%）菌粉和水分比率 多糖得率（%）100 24.4150 26.52200 28.86250 27.68300 25.1120:1 26.6625:1 28.0130:1 29.5635:1 28.9540:1 27.693.3 浸提时间、温度、PH 值对多糖得率的影响结果见表3。当菌丝浸提时间分别为1、1.5、2、2.5、3、3.5h 时,可以看出随时间的延长,多糖得率逐渐增加,到2.5h 时达到最高得率,后又随着时间得延长而下降,这可能是因为浸提时间过长菌丝中其他物质也被浸提出来,使得浸提液变得粘稠,不利于后续乙醇沉淀时多糖析出,从而影响得率。同时长时间浸提对多糖的物理、化学性质也会产生不良影响, 可能引起糖结构的变化和破坏,甚至使其中的五碳环或六碳环裂解,导致多糖得含量下降。因此,采用浸提时间为2.5h。从图 4 可以看出,热水浸提温度对多糖的提取工艺有很大的影响,55浸提下得多糖得率比 85浸提时低约 50%, 6585之间多糖的得率上升的很快,而 8595之间多糖的得率变化趋于平稳,因此确定浸提温度为 85。按基本方法向一定量的干菌丝中加入一定比例的蒸馏水,用NHCI溶液和NnaOH 溶液调节PH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0, 浸提多糖结果如图5。从图5可以看出PH 值为7.0时多糖得率最高,这是因为在酸性和碱性条件下会影响水溶性多糖的溶出,因而在中性条件下多糖的得率最大。因此,多糖析出的最适PH值是7.0。本科毕业论文（设计）6表3 浸提时间、浸提温度、PH值对得糖率的影响Table 3 leaching time, leaching temperature, PH value of sugar rate as well3.4 浸提次数、浸提液浓缩比例、乙醇沉淀剂倍数对多糖得率的影响结果见表4。精确称取已粉碎好的干菌粉, 按一定比例加入蒸馏水, 摇匀后, 温水浸提1h 后去出用滤纸过滤,取滤渣重复浸提量刺( 条件同上) ,分别取滤液,测多糖含量计算得率, 从表4可以看出, 浸提三次与两次相比效果不明显。所以本试验浸提次数确定为两次。分别取10、20、30、40、50mL 浸提液加热浓缩至10mL, 加30mL 乙醇冷冻沉淀, 测多糖得率见图7。可以看出, 浸提液浓缩后对多糖得率影响不大, 尽管可以节省乙醇用量, 但在浓缩过程中, 高温加热易对多糖产生不良影响, 如颜色加深, 多糖焦化不易沉淀析出等。因此, 建议如有条件采用真空浓缩可以避免不良影响, 进行浓缩后再沉淀多糖可以节约乙醇用量, 如无条件, 还是不要对浸提液进行浓缩。取10mL 浸提液分别加入10、20、30、40、50ml 乙醇冷冻沉淀, 测多糖得率见图8。可以看出当加入3倍乙醇时多糖得率显著上升, 而35 倍之间则上升的比较缓慢, 从节约原料角度考虑确定加入乙醇倍数为3倍。表4 浸提次数、浸提液浓缩比例、乙醇沉淀剂倍数对多糖得率的影响Table 4 frequency of leaching, leaching solution concentration ratio, ethanol precipitation agent ratio affect the yield of polysaccharide from浸提时间（h） 多糖得率（%） 浸提温度（） 多糖得率（%） Ph值 多糖得率（%）1.0 23.63 55 14.35 1.0 23.121.5 25.32 65 22.65 5.0 26.252.0 27.98 75 27.69 6.0 28.082.5 28.92 85 28.86 7.0 28.883.0 27.98 90 28.66 8.0 26.92 3.5 27.63 95 28.70 9.0 25.83浸提次数 多糖得率浸提液浓缩比例 多糖得率乙醇沉淀剂倍数 多糖得率1 16.202 28.963 28.98 1：1 26.652：1 26.453：1 26.344：1 26.435：1 26.331：1 24.322：1 25.553：1 28.934：1 28.985：1 28.96：猪苓多糖分离提取工艺研究74 结论与讨论本试验从菌粉粒度，料液比，浸提时间浸提温度，浸提次数，浓缩比例，PH值，乙醇沉淀比例等多方面多层次的研究了猪苓液体培养菌丝体多糖提取工艺的优化。本试验研究结果表明: 猪苓液体发酵干菌粉提取多糖的最佳粒度是200 目; 浸提加水倍数为30; 浸提时间为2.5h; 浸提温度为85; pH 值为7.0; 浸提次数2 次; 浓缩比例不影响多糖得率; 乙醇沉淀剂比例为31。本科毕业论文（设计）8参考文献1 雷萍, 孙悦迎, 张鑫, 等. 猪苓发酵菌丝多糖分离提取工艺研究 J . 中国食用菌,2006, 5( 25) : 45-47.2 戴肖东, 张欣, 韩增华,等.野生猪苓菌丝分离培养试验初报J .食用菌, 2001, ( 6) : 1011.3 秦俊哲, 陈明, 陈合, 等.食药用真菌多糖的研究现状与展望J .中国食用菌, 2003, 23 ( 2) : 68.4 严术常, 曹望芳, 张英华等. 猪苓多糖治疗慢性病毒性肝炎的临床和实验研究. 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