聚唾液酸和唾液酸提取工艺的研究

1摘要唾液酸是广泛存在于生物系统中的一类天然糖类化合物，唾液酸类化合物在生命体许多重要的生物、生理过程中发挥着不可或缺的作用。聚唾液酸是唾液酸单体以 -2,8 或 -2,9 糖苷键连接起来的线性聚合物，是少数几种细菌的胞外多糖组分。通过微生物发酵法可以大量生产聚唾液酸，聚唾液酸再经过水解后，分离纯化可以得到唾液酸，再结合化学法和酶法可以转化成为药用价值很高的唾液酸类衍生物。利用分批补料发酵工艺，在 50L 半自动发酵罐中发酵生产聚唾液酸。发酵最终的聚唾液酸产量为 2800mg/L.在前人的基础上改进了从发酵液中提取聚唾液酸的工艺，将乙醇沉淀-过滤和碱性过滤的方法结合起来，该工艺条件为：取一定体积的发酵液，加入 4%的 NaCl，完全溶解后，用三倍体积的酒精沉淀，完全沉降后，弃去上清液，沉淀物用水复溶，用珍珠岩作助滤剂过滤，得到的滤液调节 pH10.0，再过滤，得到的滤液调回 pH7.0。利用该方法可以除去发酵液中 91.2%的杂蛋白，而聚唾液酸的回收率为 85.4%。利用氯代十六烷基吡啶对聚唾液酸有特异性的络合效应来进一步分离纯化聚唾液酸。通过单因素分析和正交分析确定了氯代十六烷基吡啶与聚唾液酸发生络合和解离的最优工艺条件，即：络合时 NaCl 浓度 0.05mol/L，pH6.0，加入的氯代十六烷基吡啶的量为聚唾液酸的 3 倍（w/w） ；解离时 NaCl 浓度 0.8mol/L，解离温度 50。得到的聚唾液酸的纯度在 95%以上，回收率在 80%以上，并且通过红外光谱证实其纯度和结构。利用实验室前人的工艺将得到的高纯度的聚唾液酸进行水解、脱色和结晶，最终得到的唾液酸产品的纯度在 90%以上。关键词：聚唾液酸；唾液酸；发酵；提取；分离纯化。2第一章 绪论1.1 简介 唾液酸（sialic acid, PSA）又称燕窝酸，是中国传统珍稀食品燕窝中具生物活性的主要成份，母乳中的唾液酸为婴儿早期生长提供免疫力，提高肠道对于维生素及矿物质的吸收能力。唾液酸为神经氨酸，广泛存在于动物组织及微生物中，是细胞膜蛋白的重要组成部分，参与细胞表面多种生理功能，在调节人体生理、生化功能方面起到非常重要的作用。唾液酸近年来才在国际上被系统地研究，科学家已经发现其具有许多重要的生物学功能性。由于唾液酸在通过消化系统时不会被消化道酶降解，可通过消化道进入肠道阻止肠道致病菌及病毒与细胞的吸附，对抵抗多种病菌起重要作用。1957 年，Blix 等用较为温和的水解方法，从颌下腺粘蛋白中分离出与 Bials 试剂反应呈紫色的物质，将其命名为唾液酸（Sialic acid） ，这个名称也用于后来发现的几种物质。此后人们用温和的水解方法从牛初乳、牛颌下腺粘蛋白和燕窝中相继分离得到完整的可结晶的唾液酸。目前，唾液酸的国际市场的价格约 50100 美元/克。 聚唾液酸(polysialic acid, PSA)是唾液酸单体以 -2,8或唾液酸和 -2,9 糖苷键连接起来的线性聚合物，分子量在 2060 KDa，是一种链蛋白酶抗性的大分子。1957 年 Barry 和 Goebel 首先在 Escherichia coli K-235 和 K-1 中发现该聚合物，以后陆续在 Neisseriaminingitidis B, Salmonella toucra 048, Citrobacter freundii 05 中发现该物质。近年来，随着对聚唾液酸理化性质、生理功能、合成与代谢等研究的深入，聚唾液酸在食品、医学等领域的应用越来越广泛。1.1. 1 唾液酸和聚唾液酸的结构唾液酸是一类神经氨酸的衍生物，是一个含有 9 个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，系统命名为 5-氨基-3, 5-二脱氧-D- 甘油-D-半乳壬酮糖。根据 5 号碳上不同的连接基团构成了不同的唾液酸衍生物。3聚唾液酸(polysialic acid, PSA)是唾液酸单体以 -2,8或 -2,9糖苷键连接起来的线性聚合物，分子量在 2060 KDa，是一种链蛋白酶抗性的大分子。-2,8 酮苷键连接的聚唾液酸末端相邻的两个单体形成内酯 (甲单体的羧基和乙单体的 9 号碳上的羟基脱水缩合形成) ,对聚唾液酸的稳定起到一定的作用, 这也是大多数的聚唾液酸以 -2,8连接的主要原因之一。4聚唾液酸主要有三种结构，如图 1-2 所示：A 叫做 PSB，来源于 N 脑脊膜或大肠杆菌 K1，是 N-乙酰神经氨酸通过 -2, 8 糖苷键连接而成的聚合物。其中 n 的平均值为 199；B 叫做 PSK92，来源于大肠杆菌 K92，是 N-乙酰神经氨酸通过 -2, 8，-2, 9 糖苷键交替连接而成的聚合物。其中 n 的平均值为 78；C 叫做 PSC，来源于 N 脑脊膜 C，是 N-乙酰神经氨酸通过 -2, 9 糖苷键连接而成的聚合物，其中 n 的平均值为 74。1.1.2 唾液酸和聚唾液酸的理化性质纯的唾液酸是无色的，易溶于水，在水溶液中不发生变旋作用。纯的 N-乙酰神经氨酸和 N-羟乙酰神经氨酸在水溶液中很稳定，4时贮藏数月不发生变化。但是如果溶液中含有非常微量的有机酸，其稳定性就受到很大的影响。二乙酰和三乙酰神经氨酸不稳定，在常温下很易转变成 N-乙酰神经氨酸。表 1-1 为一些主要的唾液酸类衍生物的性质。51.1.3 唾液酸在体内的代谢过程61.1.4 唾液酸和聚唾液酸的应用唾液酸是真核细胞表面最丰富的末端糖基，对细胞的交互作用，病毒的感染，糖蛋白的稳定性起着非常重要的作用，其中最有代表性的是神经细胞的支持分子 N-乙酰神经氨酸 (NCAM，唾液酸的一种)，它对病毒从感染的宿主细胞中释放新复制的病毒颗粒具有重要的作用，通过抑制 N-乙酰神经氨酸可以干扰和阻止病毒的复制，达到治疗流感的目的。目前，以唾液酸( sialic acid, SA)为母体化合物进行 NA 抑制剂的研究成为抗流感药物研究的热点，已有两种治疗效果较好的药物扎那米韦和奥司米韦上市。唾液酸衍生物作为重要的抗黏附药物，可有效阻止白细胞过量聚集，治疗类风湿性关节炎、脓毒性休克等疾病。唾液酸及其衍生物还与癌细胞的粘附和转移有关，与肿瘤的恶性程度有关。同时，唾液酸是一种止咳祛痰剂，对于中心和外周性疾病以及脱髓鞘病均有疗效，如唾液酸胆固醇可以治疗老年痴呆症。此外，唾液酸在脑中的含量很高，可能作为神经传导质，参与离子外流和神经兴奋。单唾液酸神经节苷酯对于治疗脑缺血、帕金森症，此外它对神经创伤也有一定功能。以聚唾液酸为原料，可开发一系列重要的糖药物，在国际上日益发展的新一代糖药物中占有非常重要的位置。聚唾液酸( PSA)是目前发现最好的替代PEG 的多肽与蛋白类药物的可降解控释剂。英国的 LipoXen 公司临床试验了聚唾液酸化干扰素，发现其效果比 PEG 化的干扰素的半衰期更长；另外该公司还正在试验其他药物如胰岛素、天冬酰胺酶和人红细胞生长素等。最近，LipoXen 公司与印度血清研究所( Serum Institute of India LTD1)合作生产聚唾液酸，并且获得 550 万美元的风险资金用于开发治疗糖尿病、肺炎球菌感染和丙肝药物的聚唾液酸控释的药物。日本大洋化学公司的蛋黄唾液酸低聚糖是用蛋黄制取的一种功能性碳水化合物，可作为婴儿的食品配料和营养增补剂。赞臣公司也在其配方奶粉中提高了唾液酸含量,使其更接近母乳的黄金标准。美国 Neose 医药公司目前正在研究用唾液酸抗粘附药物来对付幽门螺旋杆菌以治疗胃溃疡和十二指肠溃疡。另外，由于聚唾液酸性能稳定且能降解, 其降解产物对细胞培养无副作用；而且，聚唾液酸对神经组织细胞均有良好的相容性。因此，聚唾液酸是一种新型的生物相容性好的生物可降解材料，可用于神经组织工程。71.1.5 唾液酸和聚唾液酸的生产唾液酸的生产方法主要有化学合成法、酶法合成、天然物抽提法、微生物发酵法。1. 化学合成法 用 N-乙酰甘露糖胺和二叔丁基氧代丁二酸的钾盐缩合，在碱的催化下经脱羧反应可生成 N乙酰神经氨酸。在酸性醇溶液中，在铟的催化下，对 N-乙酰甘露糖胺用 -溴甲基丙烯酸进行丙烯基化，再进行臭氧分解得到 N-乙酰神经氨酸。使用化学法合成唾液酸反应条件苛刻，需要铟等一些贵重金属作为催化剂，唾液酸收率较低。另外，化学法合成常常需要和酶法合成结合起来。2. 酶法合成利用 N-乙酰甘露糖胺、丙酮酸钠和 ATP 在唾液酸醛缩酶的催化下合成 N-乙酰神经氨酸。酶法生产唾液酸具有转化率高、提取简单、产品纯度高等优点，但对合成所用原料要求高，价格较为昂贵，唾液酸醛缩酶不易获得，限制了生产规模的扩大。3. 天然物抽提法唾液酸以糖复合物的形式广泛存在于动物细胞表面，但其含量相当少。其中燕窝中含量最高为 67g/kg，因此有人称唾液酸为燕窝酸。其次，唾液酸在血清、禽蛋、乳清、枇杷等生物原料中含量相对比较丰富。Juneja 等从禽蛋的蛋黄膜和系带中提取唾液酸已获成功并已应用于生产，Whitehouse 等和 Ishiyama 等分别从牛乳乳清和酪蛋白中提取唾液酸，Schauer 等报道了用热乙醇法从血清中提取唾液酸。另外，国内有高剑峰等从8猪血中提取唾液酸的报道。由于唾液酸在天然原料中含量比较低，分离提纯过程比较复杂，收率较低，需要一些特殊的设备，造成的污染也大，这必然影响到唾液酸衍生物的开发和利用。4. 微生物发酵法微生物发酵属于生物化学过程，所用原料相对低廉，具有上述 3 种方法不可比拟的优点，而且聚唾液酸只能通过微生物发酵的方法得到，因而在唾液酸的生产中占据了重要的地位。聚唾液酸以荚膜的形式存在于少数几种细菌细胞表面。用液体培养时，聚唾液酸以粘液的形式释放到发酵液中。聚唾液酸进行酸水解或酶水解后，分离纯化可得唾液酸，为制取唾液酸类药物提供工业化基础。但是目前国内外对于唾液酸和聚唾液酸的研究主要集中在性质和应用等方面的研究，对于微生物发酵法生产唾液酸的研究只有少量的报道，而且都是小规模研究，基本没有工业化生产的报道。1990 年，Camino 等利用大肠杆菌 K-92 发酵生产聚唾液酸，产量为450 mg/L。1988 年， Rodriguez-Aparicio 等利用大肠杆菌 K-235 发酵生产聚唾液酸，产量为 1350mg/L，分子量在 20-60kDa。2008 年，Bastian Rode 等人对大肠杆菌 K-1 分别进行了 2L 和 10L 规模的研究，利用分批补料的方式发酵生产聚唾液酸，最终产量为 1.5g/L。我国对唾液酸生产的研究起步较晚，研究主要是关于菌种选育和培养基优化，如郭良栋等用大肠杆菌 C-8 发酵生产聚唾液酸，产量为 1200 mg/L。从 1999 年开始，詹晓北等开始利用大肠杆菌 K235 发酵生产聚唾液酸和唾液酸，研究了 pH 控制的补料分批发酵工艺，聚唾液酸产量达到 3500 mg/L。随着聚唾液酸和唾液酸在食品，医药等领域越来越广泛的应用，需要我们大量的生产高纯度的聚唾液酸和唾液酸，因此微生物发酵法生产聚唾液酸和唾液酸的另一个难点是分离和纯化，国内外在这方面的研究也不多，直到最近Bastian Rode 等人才报道了用丙酮、塞太弗伦（一种洗涤剂和抑菌剂）和乙醇从发酵液中分离纯化聚唾液酸，最终得到的聚唾液酸的纯度在 90%以上，总的回收率为 65%。在国内，有报道，中科院微生物研究所已筛选到一株优良的能产生多聚唾液酸的菌株，完成了发酵中试，产酸能力达到 0.8-1g/L，且完9成了多聚唾液酸的水解成单链及纯化实验，其纯度达到了国外进口产品的水平。本实验室前人对大肠杆菌发酵生产聚唾液酸已经有了一定的研究，上游方面主要完成了对菌种的改造以及对发酵条件的优化，下游方面主要集中在唾液酸单体的分离纯化方面，而且，得到的聚唾液酸和唾液酸的纯度也并不是很高，因此，本研究在前人的基础上，进一步将发酵规模扩大化，并研究了如何从发酵液中分离纯化高纯度的聚唾液酸，为聚唾液酸和唾液酸的工业化生产服务。1.2 课题来源本课题是江苏省自然科学基金（BK99190） “唾液酸药物生产菌的筛选及其生产研究”的重要组成部分。1.3 本论文研究的目的和内容本论文的主要目的是在前人的基础上进行 50L 罐发酵生产聚唾液酸的放大性实验，然后从发酵液中分离纯化出高纯度的聚唾液酸，并将聚唾液酸水解成唾液酸单体，进行唾液酸单体的分离纯化。本论文主要完成的内容：1. 利用前人的工艺对聚唾液酸发酵进行 50L 罐的放大性研究。2. 对聚唾液酸粗提取的方法进行了研究，确定碱性过滤法为最佳方法。3.利用氯代十六烷基吡啶进一步对聚唾液酸进行分离纯化，得到了高纯度的聚唾液酸产品。4. 提取纯化唾液酸单体，并对其进行了结构鉴定10第二章 发酵液中聚唾液酸的粗提取2.1 引言 聚唾液酸发酵是典型的生长耦联型发酵，产量随着菌体的生长而增加。本实验室前人已经对聚唾液酸的发酵菌种进行了改造，并对发酵培养基，发酵工艺条件做过大量研究，使聚唾液酸产量从原始的 360mg/L 提高到4500mg/L，发酵补料工艺根据经验确定。本章在前人的研究基础上，对原工艺在 50L 机械搅拌罐进行进一步的放大性试验和研究。本实验室已对唾液酸的提取工艺做了较多的研究，得到纯度为 9