大孔吸附树脂纯化刺玫果总黄酮工艺研究

大孔吸附树脂纯化刺玫果总黄酮工艺研究论文I摘 要刺玫果学名野蔷薇,又名野刺玫果,山刺玫果,系蔷薇科蔷薇属植物山刺玫的成熟果实。广泛分布于我国的东北地区，尤以黑龙江省贮量最为丰富。现代药理学研究表明：刺玫果含有丰富的营养成分及生物活性物质，具有健脾理气、养血调经、抗衰老、防治心血管疾病、增强免疫及促智等功效。刺玫果中所含的总黄酮类物质具有预防和治疗高血脂、血栓所致的心脑血管疾病的功效，且具有高效、低毒副作用的优势。因此纯化刺玫果中的总黄酮就具有现实的科研意义。目前，常见的总黄酮纯化方法有水提醇沉法（水醇法） 、醇提水沉法（醇水法） 、酸碱法、盐析法、离子交换法和结晶法等。实践表明，这些方法也存在一定的局限性。近年出现了一些分离和纯化的新方法，如絮凝沉淀法，大孔树脂吸附法、超滤法、高速离心法等。本论文采用大孔树脂法纯化刺玫果提取物中的总黄酮。探索洗脱剂、pH值、上样浓度等因素对纯化过程的影响。采用紫外分光光度计法对总黄酮含量进行了分析，最终确定了洗脱剂的浓度75%、上样PH为5，上样浓度为原液浓度，吸附速率为2Bv/h，洗脱速率为1Bv/h。该纯化方法简单，快捷，纯化效率高，进一步拓展了刺玫果的应用领域和范围，为刺玫果的全面和综合利用提供科学的理论依据。关键词：刺玫果 总黄酮 大孔树脂法 纯化大孔吸附树脂纯化刺玫果总黄酮工艺研究论文IIAbstractRosa multiflorais is the scientific name of Rosa davurica pall，also known as Wild rosa fruit. Rosa mountain fruit,this fruit is the Rosa mountain fruit of Rosaceae genus Rosa.It is growing in east-north China, especially in province of Heilongjiang. Modern pharmaceutical research shows that Rosa davurica Pall contains rich nutrients and bioactive substances, anti-aging, prevention and treatment of cardiovascular disease, enhances immunity and the efficacy of nootropic, etc. Total flavonoids in the Rosa davurica Pall possess the function of prevention and treatment of high blood lipids, thrombosis dued to cardiovascular and cerebrovascular diseases. It has properties like high-efficiency and the advantages of low toxicity side effects.Thus it is worth in doing research on refining total flavonoids in the fruit. Recently, there are the several common methods in purifying Flavonoids such as water-extracting alcohol-precipitating,alcohol-extracting water-precipitating,acid-base method, saltdopositing,io-exchange and crystallization,and so on.In practice, there is the limit in all these method reported.Some new methods are investigated like flocculation precipitation, macroporous resin absorption,ultrafiltration,high-speed centrifugea- tion, and so on.In this thesis, we report extraction of total flavonoids from Rosa davurica pall by using the method of Macroporous resin.It was investigated basing on how the type of Eluant,PH of solution,concentration of samples influences purification.Using Ultraviolet spectrophotometer method to analyze Flavonoids,This method is to know the content of total Flavonoids by measuring Ultraviolet absorption. As a result, it was found that the concentration of Eluant is 75 % ethanol, pH is 5 and the sample concentration is concentration of original solutionl, Adsorption rate is 2Bv / h, Elution rate is 1Bv/h. This method is simple, rapid and high-efficient. This research have obtained some scientific results which will board the application of Rosa davurica pall .Keywords：Rosa davurica pall Total Flavonol Macroporous resin purification 大孔吸附树脂纯化刺玫果总黄酮工艺研究论文I目 录摘 要 .IABSTRACT .II1 绪 论 .11.1 课题背景 .11.2 项目的目的意义 .11.3 有关刺玫果的介绍 .21.3.1 药材来源及植物特征 .21.3.2 刺玫果的化学成分 .21.3.3 刺玫果的药理作用 .31.3.4 刺玫果的营养价值 .41.3.5 刺玫果的生物学特性 .51.3.6 刺玫果的开发前景 .51.4 黄酮类化合物的研究 .61.4.1 黄酮类化合物的文献综述 .61.4.2 黄酮类化合物的分类 .61.5 黄酮类化合物的国内外研究进展 .71.5.1 提取工艺的研究进展 .71.5.2 精制工艺的研究进展 .81.5.3 总黄酮的含量测定方法 .101.5.4 分离方法研究进展 .121.5.5 分析鉴定的研究进展 .132 实验部分 .15大孔吸附树脂纯化刺玫果总黄酮工艺研究论文II2.1 实验仪器和设备 .152.2 实验药品与试剂 .152.3 实验原理和方法 .152.3.1 实验原理 .152.3.2 实验方法 .162.4 实验步骤及实验流程图 .162.4.1 实验步骤 .162.4.2 实验技术路线 .162.5 实验操作部分 .172.5.1 方法学研究 .172.5.2 大孔树脂法纯化刺玫果总黄酮的工艺研究 .212.5.3 大孔树脂的静态吸附及解吸 .212.5.4 大孔树脂的动态吸附及解吸 .232.5.5 大孔树脂工艺优化研究 .242.5.6 树脂的重复性使用 .333 结果与讨论 .333.1 大孔吸附树脂纯化方法的讨论 .333.1.1 大 孔 吸 附 树 脂 法 .333.1.2 上样浓度的讨论 .343.1.3 吸附速率考察 .343.1.4 解吸乙醇浓度的考察 .353.1.5 洗脱速率考察 .35大孔吸附树脂纯化刺玫果总黄酮工艺研究论文III3.1.6 洗脱终点考察 .353.1.7 上样液 PH 值的考察 .36参考文献 .38致 谢 .39药理作用和化学成分1百手起驾 整理为您1 绪 论1.1 课题背景刺玫果学名野蔷薇,又名野刺玫果,山刺玫果,系蔷薇科蔷薇属植物山刺玫的成熟果实。广泛分布于东北及内蒙、山西、河北等省。该果实酸甜可口，含有丰富的营养成分及生物活性物质，民间大量采食或用于泡茶、泡酒等。现代研究表明刺玫果具有健脾理气、养血调经、抗衰老、防治心血管疾病、增强免疫力的功效，刺玫果中所含的总黄酮类物质具有预防和治疗高血脂、血栓所致的心脑血管疾病的功效，且具有高效、低毒副作用的优势 1。目前刺玫果正在作为一种天然保健药物被日益重视和广泛开发。医学研究表明：心脑血管疾病已成为中老年人群中发病率较高的一项顽疾。当今社会人口老龄化已成为很多国家面临的普遍问题，我国人口老龄化的现象也日益突出。因此市场上对治疗心血管疾病的药品需求量很大。鉴于刺玫果中含有丰富的总黄酮，开发该药物的社会前景和市场前景就非常可观。为了提高对该药材质量的控制，我们采用大孔吸附树脂法以芦丁为标准品对刺玫果中总黄酮提取进行研究，为提取刺玫果中有效物质提供一定参考。1.2 项目的目的意义刺玫果具有很高的经济价值和营养价值，根、茎、花、果实都可入药。 中华大辞典称：刺玫果具有健脾理气,养血调经之功效。前苏联第八、九版药典亦有收载,用于治疗坏血病。现代医学研究发现，刺玫果具有抗衰老、抗疲劳、耐缺氧，增强人体免疫功能作用，长期服用能显著提高人体的 SOD 含量 2。据有关资料记载：天然刺玫果是治维生素缺乏症的良药，各种制剂可用来治疗血压、动脉粥样硬化、脑溢血、肝、肾、胃溃疡。还具有显著的抗衰老、抗疲劳、抗辐射、耐缺氧、治血栓、降血压、防癌、治癌、强身壮阳、健脑增智、延年益寿的作用。由此可见，天然刺玫果是一种不可多得的食、药同源的宝贵资源 3。目前刺玫果正在作为一种天然保健药物被日益重视和广泛开发。市场上已出现有以山刺玫果为主研制的“刺玫果保健茶” 等保健食品及保健饮料, 它又是各类食品不可多得的添加剂，也可直接生产果酱、果冻、果脯等食品。临床已研制出以刺玫果为原料的“冠心病口服液” 等注射液和口服液 4。综上所述，刺玫果具有极高的营养价值和生理活性，具有广阔的市场开发前景。为提高刺玫果提取工艺的科学性，特以主要成分总黄酮为考察指标，采取大孔吸附树脂纯化刺玫果中的总黄酮，以多种树脂共同吸附黄酮,考察其吸附率及解析率,寻找最优树脂。并进一步采用单因素探索实验和正交试验优选其提取工艺的最佳条件。对刺玫果中总黄酮的提取方法做了进一步探索，通过实验找出最经济实惠，效率较高的方法，能实现实际的工业生产。为今后刺玫果的综合利用及其相关领域的深入研究提供了新的思路,并为刺玫果的药理作用和化学成分2百手起驾 整理为您进一步开发应用奠定了良好的基础。1.3 有关刺玫果的介绍1.3.1 药材来源及植物特征1形态特征野生刺玫果为落叶小灌木，茎直立，多皮刺，株高 0.82m 。根为木质，粗长，暗褐色，枝暗紫色，无毛，小枝及叶柄基部有成对的皮刺，刺稍弯曲或直。叶互生，奇数羽毛状复叶，小叶 57 个，小叶长圆形或阔披针形，长 11.3cm，宽 0.51.5cm，先端尖或稍钝,基部圆形或楔形，边缘具细锯齿，正面深褐色无毛，背面灰白色有粒状腺点及短柔毛，叶柄有腺体，托叶宿存。花两性，整齐，花梗稀膨大，花托坛状，稀为杯状，萼裂片5，稀为 4，宿存，花单生或 23 朵并生，深红色或绛紫色，直径 4cm。果实球形或卵球形，直径 11.5cm，呈红色或橙黄色，果肉的果边萼片基部有茸毛，种实为瘦果，多数包于花托内而成聚合果，果熟时花托肉质，果实为冬不落果。2生活环境野生刺玫果生长于林缘开阔地、河流两岸、山坡灌木丛及杂木林中。阳性树种，喜光，但稍能耐阴，结果生长性状好的郁闭度不超过 0.3。土壤类型为壤土及沙质壤土，耐瘠薄，在有机质含量很低的沙滩地和防洪水坝上生长良好，不适宜通透性差的粘重土壤，对水分要求不严格，耐干旱，不适宜长期水涝环境。以群丛分布为主，很少单生。1.3.2 刺玫果的化学成分刺玫果果实中含有丰富的维生素 C、氨基酸、有机酸、糖、果胶、类胡萝卜素、酸类化合物、无色花色素、儿茶素、维生素 A、B 1、B 2、K、E、P 和黄酮、糅质化合物等多种矿物质 7。现分类如下：1.维生素类刺玫果含丰富的维生素（mg/100g）：Vc1274-2264，远高于苹果、橘子、猕猴桃等水果。VA10.90，VE18.75，VB10.32，VB20.40，VP0.54，被成为天然多种维生素浓缩物。药理作用和化学成分3百手起驾 整理为您2.矿物元素从刺玫果干果及鲜果中共检出了 28 种矿物元素，其中 11 种为人体必需的矿物元素，如钾、磷、钙、钠、镁、锌、铜、铁、锰等。3.脂肪油从刺玫果种籽中提取的脂肪油主要由高级脂肪酸及呋喃类衍生物组成。已经鉴定的脂肪酸有硬脂酸、软脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸等，呋喃衍生物有糠基乙酸酯、正己基呋喃、2-呋喃基戊醛等。4.三萜该类化合物主要是从刺玫果甲醇提取物的氯仿、乙醚及乙酸乙酯萃取部分中分离得到的，已报道的有：齐墩果酸、白桦脂酸、熊果酸、2-羟基齐墩果酸、2-乌苏酸、19-二羟基乌苏酸、2，3，19-三羟基乌苏-12-烯-28-酸等。5.氨基酸刺玫果含 17 种氨基酸，包括 7 种人体必须的氨基酸，游离氨基酸总量为273.4mg/100g，水解氨基酸总量为 368.6 mg/100g，其中精氨酸含量最高。6.黄酮该类化合物是从刺玫果甲醇提取物的正丁醇萃取部分中分离得到的。已报道到的有：金丝桃苷、银煅苷、橙皮苷、槲皮素。7.鞣质该类化合物是从刺玫果丙酮提取物部分中分离得到。已报道到的有：木麻黄素、刺玫果素、刺玫果素 D1、D 2、T 2，龙芽草素，金樱子素及特有成份 1、2、3、6四氧没食子酰-D葡萄糖，1、2、3、4、6四氧没食子酰-D葡萄糖等。8.其他从刺玫果中分离出来的还有蜡酸、二十七烷、-谷甾醇、胡萝卜苷、-谷甾醇乙酸酯、乙基-吡喃果糖苷等单体化合物。1.3.3 刺玫果的药理作用据中国中药大辞典记载：花：甘、微苦、温。止血、理气、解郁、调经。治吐血、血崩、肋间神经痛、月经不调、肺结核咳嗽、腹泻。果：酸、温、健脾胃、助消化，用于消化不良、食欲不振、胃腹胀痛、小儿积食、动脉粥样硬化、咳嗽、腹泻及维生素 C 缺乏症。根：苦、涩、平。止咳祛痰、止痛、止血。用于慢性气管炎、肠炎、细菌性痢疾、胃功能失调、膀胱炎、功能性子宫出血、跌打损伤 8。经过现在研究者系统的药理学研究表明，刺玫果还有如下的药理作用 9： 1.抗衰老作用刺玫果能提高人和小鼠体内超氧化物歧化酶（SOD）活性，抑制过氧化脂质（LPO）和脂褐素的形成，清除体内的有害自由基，从而延缓衰老。黑龙江老年医学研究所对 100 例药理作用和化学成分4百手起驾 整理为您健康老人的临床测试表明服用刺玫果浸膏粉后，能使 68.66%受试者睡眠增加，71.64%食欲增加，64.28%精力增加，70.15%体力增加，62.86%肺活量增加，56.72%听力增加。可见，刺玫果对老年人有很好的保健作用 10。2.对心血管系统的作用刺玫果水提物及醇提物均可降低大鼠、兔的血压及脑血管阻力，增加冠脉流量，抑制血小板聚集，延长凝血时间，抑制血栓形成。临床测试发现老年人服用刺玫果浸膏粉后，血流速度明显加快，血液粘度明显下降。以刺玫果为主组成复方制剂治疗脑血栓、脑动脉硬化及冠心病 133 例，临床总有效率为 83.3%。刺玫果这些作用与所含黄酮化合物有关 11。3.增强免疫作用刺玫果能明显提高小鼠血清半数溶血值，增强机体的体液免疫功能。对噪音所致小鼠免疫功能低下有扶正作用，对二硝基亚胺所致大鼠的免疫器官胸腺、脾的萎缩有显著拮抗作用，并能减轻环磷酰胺化疗及 60Co 放疗给荷瘤小鼠白细胞数量及免疫器官所造成的损伤。4.抗疲劳、耐缺氧和类性激素作用刘中申等进行了小鼠荷重游泳实验及减压耐缺氧实验，结果刺玫果组存活时间显著高于空白对照组。临床观察也发现刺玫果酒剂能明显改善老年人失眠多梦、疲劳健忘及性功能衰退等症状。5.保肝作用刺玫果对实验性酒精、氯仿及亚硝酸钠+氨基比林分布引起的小鼠肝损伤均有显著拮抗作用，能抑制这些肝损伤剂对小鼠谷丙转氨酶的增高及肝细胞的纤维化转变，此作用可能与刺玫果富含齐墩果酸及维生素 C 有关 13。6.防癌作用氮-亚硝基化合物是一类强致癌物质，人类某些肿瘤的发生有着密切的关系。刺玫果可阻断二甲基亚硝胺在动物体内外的合成，其阻断率（98.49%）远高于同浓度维生素 C 的阻断率（9.04%） 。此外，刺玫果可拮抗放射性辐射引起的机体损伤，能预防辐射癌变 14。7.促智作用通过跳台实验、迷宫实验及药物所致记忆障碍实验表明，刺玫果复合制剂能明显提高小鼠记忆力，可对抗东莨菪碱所致记忆获得障碍，对氯霉素引起的记忆巩固不良和400mL/L 乙醇引起的记忆再现障碍亦有拮抗作用 15。8.其他刺玫果有促进动物 DNA、RNA 及蛋白质合成的作用，并且对 DNA 损伤有一定的修复作用。在临床上还应用于治疗消化不良、气滞腹泻、胃痛、月经痛及顽固性淋病等。药理作用和化学成分5百手起驾 整理为您1.3.4 刺玫果的营养价值从刺玫果肉成分分析得出，其各种营养及疗效成分含量高，营养全面。其中维生素 C含量高达 2720mg/100g，微量元素 Se 含量高达目前所报道的果品、蔬菜及其他食品中极少见的高含量。维生素 C 和微量元素 Se 是目前所知动、植物中含量最高的，微量元素 Se 比号称富硒植物的中药黄芪（含 Se）含量高是十倍 7。同时，刺玫果中还含有多种黄酮类物质及本文中未测定的其他多种维生素类、活化酶类、药效成分等。称刺玫果为大地果实维生素 C 之冠和抗衰老药物的后起之秀，确是当之无愧。在当代迅速发展的抗衰老药物研究中，作为人类抗衰老的天然添加剂及其综合利用，刺玫果将具有重要意义。现代药理研究证实的有维生素 E、维生素 C、胡萝卜素、芸香甙类、硒元素及抗氧化酶等，此类抗氧化剂均有提高肌体免疫力、抗癌、解毒、降低过氧化酯质、降血清胆固醇等作用。刺玫果中维生素 E、胡萝卜素含量很高（1956 年