糖尿病发生发展的分子机制研究项目申报

项目名称： 2型糖尿病病理生理变化的分子机理研究首席科学家： 贾伟平 上海交通大学起止年限： 2011.1至 2015.8依托部门： 上海市科委 教育部二、预期目标总体目标：阐明中国人中与2型糖尿病发生发展相关的易感基因以及表观遗传因素；发现与2型糖尿病密切相关的主要营养素失衡及其作用机制，发现遗传因素与环境因素的交互作用对疾病的影响；确定2型糖尿病发生发展过程中内质网应激、氧化应激等细胞应激导致胰岛 细胞功能障碍、胰岛素抵抗的机制；揭示细胞应激在2型糖尿病发展过程中导致糖尿病肾病和心血管疾病的分子机制。获得一批原创性的科研成果，揭示新的2 型糖尿病干预和防治靶点。在糖尿病研究领域，培养一支临床和基础紧密结合、适应“转化型研究 ”要求的高级复合型人才队伍。五年预期目标：1. 发现与中国人2型糖尿病发生发展相关的易感基因和表观遗传变化；阐明细胞应激关键因子基因变异与2型糖尿病发生发展的关系；阐明遗传因素和环境因素的相互作用机制；为遗传因素和环境因素用于2型糖尿病及其并发症的风险评估提供理论依据；2. 发现与我国2型糖尿病密切相关的主要营养因素；发现2型糖尿病易感位点与营养因素相互作用在2型糖尿病发生发展中的作用；明确营养失衡与细胞应激在糖尿病中的分子调控机制；提出新的营养相关糖尿病危险因子和病因假说及预防和干预靶点；为建立适合中国汉族人群遗传背景和膳食特点的2型糖尿病营养干预策略提供理论依据；3. 结合遗传和环境因素，初步探讨中国2型糖尿病患者胰岛细胞发生内质网应激的独特机制；阐明脂肪酸通过FoxO1诱导胰岛细胞内质网应激的机制；寻找新的内质网应激标志分子；提供新2型糖尿病防治靶点、筛选新靶点药物；4. 探讨脂肪、肝细胞因子的分泌调控及其在肝细胞应激、肝脏胰岛素抵抗及2型糖尿病中的病理作用；开发相关试剂盒；为脂肪因子及肝细胞因子用于2型糖尿病发生发展的早期风险评估提供理论基础及临床依据；建立基于脂肪/肝脏细胞因子和脂肪-肝脏中轴的新药开发平台，为靶分子作为药物开发提供理论基础；5. 从线粒体能量代谢角度，探讨UCP2介导糖尿病肾病足细胞损伤的分子机制；从细胞自身稳态调节和异常转分化的角度，探讨足细胞在高糖环境下由氧化应激和内质网应激介导的蛋白尿和肾小球硬化的分子机制，寻找减少足细胞凋亡、蛋白尿的新方法。探讨氧化损伤白蛋白诱导血管细胞的应激和损伤，促进加速性动脉粥样硬化的发生和发展的分子机制，寻找新的致病分子、致病环节，探索新的干预途径；6. 阐明与2型糖尿病大血管病变直接相关的内皮细胞和平滑肌细胞代谢和氧化应激变化图谱；获得血液或尿液中可用于糖尿病心血管并发症早期诊断和病情监测的特异性分子标记物，筛选出存在于糖尿病病人呼吸气体中代谢相关分子标记；为将GLP-1用于糖尿病心血管病并发症的防治提供基础和临床研究资料。7. 建立一支临床和基础紧密结合的多学科交叉的 2型糖尿病研究梯队，并实现从实验室到临床（bench to bedside）的完整对接；8. 在国际学术期刊上发表 100篇以上学术论文，并在Cell、Nature、Science 等国际一流杂志上发表若干篇论文。申请1520项国内外发明专利。开发相关试剂盒，用于2型糖尿病发生发展的早期监测和早期防治。三、研究方案总体研究思路：本项目的总体研究思路由两个部分组成：第一部分主要是研究2型糖尿病发生发展中的遗传因素与环境因素，以及二者间的相互作用。这部分的研究技术路线包括：利用已有的大规模横断面和随访5-13年社区样本、2型糖尿病患者样本、2型糖尿病家系样本，结合已有的糖脂代谢及并发症检测中的金标准指标、以及体力活动、饮食习惯等信息，采用全基因组范围外显子组深度测序、高通量SNP检测等技术，运用大样本病例对照关联分析、家系关联分析等分析手段，发现与2型糖尿病发生发展密切相关的遗传因素，并通过遗传流行病学和表观遗传学的分析和研究，阐明遗传和环境因素在2型糖尿病发生发展中的相互作用。同时在中国人群中分析脂肪酸种类和比例、重要维生素、主要矿物元素等营养因素与2型糖尿病的关系，及其与遗传因素的交互作用。第二部分是以内质网应激和氧化应激等细胞应激为研究切入点，采用基因敲除、转基因、RNA干扰以及其他分子生物学技术，利用代谢组、蛋白质组学等系统生物学研究手段，并结合葡萄糖钳夹等糖代谢病理生理评价金标准，在分子、细胞、整体动物和人体组织等层面，研究2 型糖尿病发生发展过程中胰岛细胞受损、肝脏胰岛素抵抗的分子机制；同时还要研究2型糖尿病发展过程中肾脏和心血管病变的关键分子和作用机制。在围绕细胞应激开展糖尿病及主要并发症的分子机制研究的同时，将注意重要指标的量化和标准化。技术路线：1. 2型糖尿病发生发展中遗传因素的发现及其作用机制研究：1) 2型糖尿病及并发症的易感基因研究：在前期获得的2型糖尿病全外显子组范围深度测序信息的基础上，针对新发现的潜在的2型糖尿病易感基因开展大样本关联研究。同时，以本项目其他课题组新发现的与细胞应激关键因子为研究对象，分析基因变异与糖尿病发生、发展的关系。应用时间飞行质谱生物芯片技术，开展大样本、高密度SNP基因型检测。从样本库中选取横断面病例- 对照人群（N7,000）以及家系样本（N3,000），研究SNP 与2型糖尿病及其并发症的相关性，在大样本北方人群和5年随访的前瞻人群进一步验证，确认影响2型糖尿病发病和糖尿病并发症的易感基因，研究遗传因素与环境因素（体力活动、饮食习惯等）的相互作用在糖尿病发生、发展中的作用。2) 易感基因的功能研究：我们将进一步对已经发现的基因变异开展功能研究。通过生物信息学分析基因变异的出现位点、发生频率、SNP多态性类型以及与下游表达蛋白之间的关系；通过结构生物学和分子生物学手段构建变异基因发挥功能的生物大分子，解析其与野生型功能分子之间的差异，从分子水平获得基因变异所致的功能分子缺陷；最后使用蛋白质组学方法分析野生型和变异基因所导致的体内表达谱的整体变化，建立易感基因与疾病发生关联的完整模型。3) 开展糖尿病表观遗传学研究：从已建立的糖尿病和正常血糖者组织库中选取年龄、性别，肥胖程度、生活方式等因素匹配的糖尿病患者和正常血糖者的骨骼肌、脂肪或肝脏组织标本。提取组织的基因组DNA，采用MedIP或MAP的方法对甲基化DNA区域进行富集，运用深度测序方法获得两组间存在差异的甲基化区域信息。在此基础上采用BSP或MSP技术，扩大样本验证前期结果。分析重要靶组织中甲基化差异与基因表达水平的关系，以及这些差异与2型糖尿病发病的关系。4) 开展糖尿病与肝癌的机制研究：从肝癌组织库中选取伴有和不伴有糖尿病的肝癌患者肿瘤及癌旁组织标本，应用SPSS统计分析肝癌患者的预后与糖尿病的关系；通过免疫组化方法在组织芯片上检测肝癌患者肿瘤微环境中FOXP3，CD68，IL ，Th1,Th2和Th17等因子表达水平的改变与糖尿病发生的关系，明确糖尿病在肝癌进展过程中的作用；应用基因芯片进行基因组学研究，筛选伴有糖尿病的肝癌患者的肿瘤及癌旁组织中与肝癌患者术后转移复发相关的关键基因，并在大样本人群中进行验证，应用生物信息学手段建立分子调控网络，以阐明糖尿病影响肝癌发生和发展的分子机制。通过脂质受体分析，筛选糖尿病引发的与肝癌相关脂质受体，并进行功能研究，阐明糖尿病- 脂质受体- 肝癌三者之间的关系。5) 研究端粒与糖尿病的关系：在3,000例2型糖尿病与3000例对照样品中进行定量PCR，采用 RNase P这一 2拷贝基因作为内参，使用端粒特异性引物扩增曲线Ct 值与 RNase P扩增曲线的Ct值的比值（T/S ratio ）衡量每一个体的端粒长度。使用回归方程对个体的端粒长度与糖尿病发病之间的相关性进行分析，在分析中校正年龄，BMI，性别，吸烟状况等对端粒有影响的因素。在糖尿病病例中，计算患病时间对端粒缩短速度的影响，同时，分析一些与2型糖尿病密切相关的炎性指标（如CRP等）与端粒长度的之间的关系。 此外，将通过3次随访，进一步研究端粒与血糖转归的关系。2. 营养因素与2 型糖尿病的关系及作用机制研究：1) 营养、遗传因素与2型糖尿病的人群和相关机理研究： 脂肪酸与2型糖尿病的流行病学研究：运用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测对3210位参加基线研究的京沪城乡居民的红细胞膜的饱和、单不饱和、多不饱（n-3,n-6） 、以及反式脂肪酸组成和比例，并结合基线和追踪研究收集到膳食（24小时膳食回顾和过去1年的食物频度问卷）和体力活动等数据，以及空腹血糖、糖化血红蛋白、胰岛素、HOMA-S、HOMA-B，总胆固醇，LDL 和HDL 胆固醇，甘油三脂，以及各种细胞因子（脂联素、视黄醇结合蛋白-4，抵抗素、C反应蛋白和IL-6 ）等数据，系统地研究脂肪酸的种类、数量和比例与炎性反应和2型糖尿病发生发展的关系，以及膳食结构尤其是脂肪摄入与红细胞膜脂肪酸种类和比例的关系。 维生素与2型糖尿病的流行病学研究：运用酶联免疫吸附法、HPLC- 电化学检测方法和放射免疫分析分别检测红细胞膜B族维生素，以及血液同型半胱氨酸和25-羟基维生D的浓度。并结合基线和追踪研究收集到膳食数据、上述糖脂代谢指标、以及细胞因子数据，动态地研究营养状况变化对2型糖尿病发病风险的影响。 矿物元素与胰岛素抵抗、2型糖尿病的人群和相关的机理研究：采用ICP-MS测定钙、镁、铁、锌、硒、铬，并结合上述膳食数据和血糖、血脂、细胞因子、以及血浆铁蛋白水平，25-羟基维生素D等数据，系统地研究主要矿物元素对2型糖尿病发病风险的影响，并以铁代谢紊乱为表型的基因敲除小鼠为模型，通过膳食诱导探讨铁失衡与糖尿病发生的分子机制。 遗传关联分析和基因- 营养相互作用研究：从HapMap 下载中国汉族人群的PPARG、PPARD、GC、GYP27B1 、CYP24A1 、CDR、TMPRSS6和HFE基因的所有SNP位点的基因型数据，选取标签SNP；采用TaqMan SNP基因分型系统，在3,210普通汉族人群样本中对上述SNP位点进行基因型分析，找出若干种中国汉族人群内与2型糖尿病及其相关表现型有关联关系的基因易感位点及其单倍型；分析PPARG 和PPARD 基因的变异与红细胞膜脂肪酸的相互作用对2型糖尿病及其相关性状的影响；分析GC、GYP27B1 、CYP24A1和CDR基因的变异与维生素D 的相互作用对2型糖尿病及其相关性状的影响；分析TMPRSS6和HFE基因的变异与铁蛋白的相互作用对2型糖尿病及其相关性状的影响。2) 血脂、炎性细胞因子与胰淀素表达及2型糖尿病的发生： 利用小鼠胰岛细胞株 MIN6、原代培养的小鼠胰岛细胞通过Real-time PCR 和Western blot研究炎性细胞因子（TNF-、MCP-1）对胰淀素表达的调节作用，并进一步利用生化与分子生物学手段探讨TNF-和MCP-1发挥调节作用的分子机制。 在肥胖症和胰岛素抵抗人群及对照人群（各500例）测定血压、体质指数、血糖、血脂、血浆炎性细胞因子、脂肪细胞因子及胰淀素水平，研究血脂水平、血浆炎性因子水平与胰淀素水平的关系，以验证体外实验的结果。探讨血浆胰淀素升高与代谢综合征、胰岛素抵抗和2型糖尿病发病的相关关系。3) 高危人群的营养干预研究：采用随机化对照，平行试验设计方案，将招募到的300名患有代谢综合征的志愿者，随机分为：（1）对照组：给予不含干预食物的点心（碳水化合物：脂肪：蛋白质=55：30：15） ；（2）亚麻子干预组：每天食用含有30克亚麻子的面包；（3）核桃干预组：每天食用含有30克核桃的面包。同时，根据美国心脏联合会（AHA）推荐的方法对所有志愿者进行膳食和生活方式指导。收集干预前后的膳食，体力活动、用药情况和体格检查数据，以及血样和尿样。测定空腹血糖、血脂、糖化血红蛋白等常规指标。并采用ELISA方法测定胰岛素、炎性因子、细胞因子、氧化应激水平指标及内皮细胞功能指标等。3. 内质网应激导致胰岛细胞凋亡的作用机制研究：1) 制备内质网应激细胞模型，选择内质网应激小鼠模型：在小鼠胰岛细胞系MIN6细胞和ob/ob或者db/db小鼠原代胰岛细胞中加入脂肪酸或者衣霉素，通过检测内质网应激标志分子CHOP的转录和表达水平，选择脂肪酸或者衣霉素的处理浓度和时间，并确定本课题选用的糖尿病模型小鼠的周龄。2) 验证 ChIP-DSL 的结果：针对部分发生 2 倍以上变化的靶基因，设计引物，通过在小鼠胰岛 细胞系 MIN6 细胞中加入脂肪酸，刺激一定时间后，用FoxO1 抗体做染色质免疫共沉淀（ChIP ）实验，初步验证芯片结果的可靠性。3) 构建启动子萤光素酶报告质粒，进一步验证这些基因是否受 FoxO1 调控，以及受调控的程度和方式：将挑选基因启动子克隆至 pGL3-basic 质粒；转染 MIN6 细胞，经脂肪酸处理，分析这些基因的启动子的活性变化；干扰FoxO1 表达，观察这些启动子在脂肪酸处理后的活性变化是否被逆转；将FoxO1 的持续失活突变体（DN-FoxO1）或者持续激活突变体（ADA-FoxO1）与启动子报告质粒共转染 MIN6 细胞，确定 FoxO1 对这些基因的调控程度；4) 采用定量 RT-PCR 及 Western Blot 的方法，进一步明确哪些基因被 FoxO1 调控：在小鼠胰岛 细胞系 Min6 细胞中加入脂肪酸处理，明确候选基因mRNA 转录及蛋白质表达水平的变化；通过干扰 FoxO1 表达和过表达 DN-FoxO1 和 ADA-FoxO1，分析候选基因在转录水平被调控的情况；分离 2 型糖尿病模型小鼠（ob/ob 或 db/db 小鼠）的原代胰岛，比较糖尿病模型小鼠与其同背景对照鼠之间这些基因的表达差异，在体验证内质网应激肥胖模型小鼠内 FoxO1 靶基因的变化。采用免疫荧光技术，观察在脂肪酸刺激下MIN6 内这些候选基因的表达量及在细胞内定位改变，合并内质网染色，观察这些基因在脂肪酸处理后与内质网共定位的可能性。5) 借助于过表达和 RNA 干扰的方法，了解候选基因对胰岛 细胞功能和数量的影响：构建候选基因的过表达和干扰腺病毒载体，感染 MIN6 细胞，观察这些基因表达的增加或缺失对 MIN6 细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能以及对细胞数量的影响；过表达或者 RNA 干扰候选基因表达后，加入脂肪酸处理一段时间，从胰岛 细胞功能以及细胞活力两方面评估候选基因的功能，希望找到数个在脂肪酸诱导的内质网应激性胰岛 细胞损伤中发挥重要作用的基因。6) 制备其中意义较大基因的转基因及基因敲除小鼠：对于那些在胰岛 细胞系和原代分离胰岛上参与内质网应激细胞凋亡功能明确的基因，建立其 细胞特异性的转基因或基因敲除小鼠模型；构建成功的小鼠进行表型分析，研究这些基因对胰岛形成及胰岛素分泌功能的影响；观察胰岛大小及形态的变化，用 Tunnel 实验分析胰岛 细胞的凋亡情况，用免疫荧光技术对 Ki67 进行染色观察胰岛 细胞的增殖情况；分离转基因或基因敲除小鼠的胰岛，观察胰岛在脂肪酸刺激下的葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能（GSIS）以及细胞活力的变化，从而了解重要候选基因对离体胰岛功能的影响。7) 筛选药物靶点：针对上述功能明确的基因，运用药物筛选系统寻找选择合适的激动剂或抑制剂，初步探讨这些基因作为 2 型糖尿病防治靶点的可能性。8) 糖尿病模型大鼠实施胃绕道手术：选择发病的糖尿病模型大鼠实施胃绕道手术，动态监控胃绕道手术组与假手术组的血糖、血胰岛素及血脂等各项代谢指标；制备胰腺切片，HE 染色观察胰岛形态及大小，免疫荧光实验分析Ki67 增殖指标的变化，胰岛素染色观察胰岛 细胞在胰岛中的比例， CHOP等内质网应激分子在胰岛 细胞中的表达水平及分布情况， Tunnel 方法观察胰岛 细胞凋亡率；分离原代胰岛，体外进行 GSIS 实验，测定胰岛素含量，测定 CHOP 等内质网应激标志分子的 mRNA 和蛋白水平，分析 PDX-1、NueroD、MafA、GCK 等与胰岛素转录及分泌相关分子的表达。9) 尿酸诱导胰岛 细胞损伤：设计大样本人群研究，通过观察糖代谢、胰岛素分泌及胰岛素敏感性等指标，进一步阐明体内高尿酸与细胞损伤的相关关系；利用小鼠原代分离胰岛和 细胞系 MIN6 观察不同浓度和处理时间条件下，尿酸对 细胞生存周期、凋亡以及 GSIS 的影响。在现有实验结果的基础上，进一步揭示尿酸造成胰岛细胞内质网和氧化应激的特异性信号传导通路，以及各个相关因素的之间的相互关系；建立 细胞特异性尿酸受体过表达的小鼠模型，通过经腹腔或皮下注射外源性尿酸，在体观察高尿酸对胰岛细胞氧化应激、内质网应激的影响。同时还可以通过给予降尿酸药物别嘌呤醇等，观察在高尿酸血症的条件下其对胰岛细胞直接或间接的保护作用。4. 内质网应激在肝脏胰岛素抵抗中的作用：1) 研究A-FABP, lipocalin-2和adiponectin在肝细胞应激发生中的作用及其和非酒精性脂肪肝、肝脏胰岛素抵抗的关系：在已建立的lipocalin-2基因敲除、adiponectin基因敲除、 A-FABP基因敲除小鼠基础上，构建双基因敲除小鼠，研究正常及诱导下脂肪肝和胰岛素抵抗的发生、炎症反应的激活、内质网应激状态。分析肝脏脂肪和肝脏胰岛素信号通路传导；采用NF-B、ATF6、IRE1、PREK、p-eLF2、XBP1 特异剪切形式、 GRP78、JNK等蛋白表达的定量及活性检测分析肝细胞炎症反应及内质网应激状态； 研究A-FABP和 /或lipocalin-2 在体内过表达与肝脏内质网应激、脂肪肝和肝脏胰岛素抵抗的关系，adiponectin过表达是否可防止上述病变的发生。利用脂肪、肝脏、特定神经细胞条件性基因敲除小鼠，研究特定基因（CPT-1A, APPL2，AMPK r2、GPR116、Ahi等）在脂肪、肝脏以及神经细胞中的缺失对脂肪及肝脏细胞因子分泌、能量代谢以及细胞应激相关信号通路的影响。检测A-FABP和lipocalin-2转基因兔和野生型兔及小鼠模型在脂质代谢及肝脏脂肪沉积过程方面的差异。在整体水平上，将利用上述动物模型的肝脏标本，探讨这几种脂肪因子的单基因或双基因缺失在正常及肥胖情况下对肝组织内质网应激反应，将以UPR反应蛋白GRP78 的表达水平，PERK磷酸化，XBP1 mRNA水平及JNK激活程度进行判定。在细胞水平上，我们将从小鼠分离原代肝细胞，研究重组lipocalin-2 ，A-FABP 或/和adiponectin蛋白对内质网应激的直接影响，并研究其信号通路。2) 肝细胞因子adropin 、FGF21 在调控脂肪及肝脏细胞功能、能量代谢和胰岛素敏感性方面的作用：对FGF2