纳米金原位合成生物传感器的构建及其对慢性粒细胞白血病BCR_ABL融合基因检测的

目 录 符号说明.文摘要.文摘要.米金原位合成生物传感器的构建及其对慢性粒细胞白血病.言.一部分 原位合成纳米金技术构建生物传感器用于过氧化氢的检测. 材料和方法. 实验结果和讨论. 小结.二部分 纳米金原位合成生物传感器对慢性粒细胞白血病. 材料和方法. 实验结果和讨论. 小结.文总结.献综述.谢.读学位期间发表的论文或待发表的论文.庆医科大学硕士研究生学位论文 1 符号说明 英文缩写 英文全称 中文全称 环伏安法 壁碳纳米管 米金 碳电极 聚糖 根过氧化物酶 氧化氢 金酸 硫堇 酸缓冲液 二胺四乙酸 分脉冲伏安法 性粒细胞白血病 断裂点丛集区 二氧化铈 城染色体 in 光原位杂交 流式细胞计数 逆转录聚合酶链反应 亚甲蓝 链羟甲基氨基甲烷盐酸盐 脱氧核糖核酸 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 纳米金原位合成传感器的构建及其对慢性粒细胞白血病要 目的： 慢性粒细胞白血病（一种早期多能造血干细胞恶性克隆增生性疾病，其典型特征是9号和22号染色体易位从而形成了t(9: 22)(即费城染色体，在分子学水平上形成了约95%的慢性粒细胞白血病患者存在这种染色体易位，因此检测 合基因对该病的早期诊断、疾病预测以及微量残留白血病的诊断等具有非常重要的临床意义：本研究拟构建一种基于纳米金原位合成技术的 化学生物传感器，并对其生物传感器的各种性能进行电化学表征，同时检测对在探索一种便捷、经济、快速、灵敏的检测手段。 方法： 1. 在一定条件下，利用壳聚糖作为还原剂和氯金酸在利用扫描电镜对修饰材料进行表征。 2. 利用硫堇作为电子介体，对过氧化氢进行检测，并对传感器的各项性能指标进行表征。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 3 3. 以采用第一步简单的方法实现纳米金在二氧化铈和多壁碳纳米管表面的原位合成为基础，再将巯基修饰的寡核苷酸探针固定组装到修饰过的合成材料的电极上。 4. 对 感器的各种电化学性能进行表征，并对实验条件进行优化。 5. 以亚甲蓝作为电化学杂交指示剂的条件下，采用循环伏安法和差分脉冲伏安法，实现对慢性粒细胞白血病 合基因的检测。 结果： 1. 合成的纳米金颗粒吸附在着粒径大小为20 用壳聚糖实现了纳米金在2. 基于纳米金原位合成所构建的过氧化氢生物传感器，能够有效的检测过氧化氢，其检测线性范围为510 0流信号和过氧化氢浓度呈现很好的线性关系，0报道的方法其灵敏度得到了一定程度的提高。 3. 制备的 化学传感器能够很好地区分人工合成的全非互补序列，说明它具有很好地特异性。本实验还对融合基因靶序列进行了定量检测，互补靶0 110现很好的线性关系，检测限为510结论： 重庆医科大学硕士研究生学位论文 4 1. 扫描电镜结果显示纳米金在 面合成成功；利用该原位合成方法构建的明纳米金原位合成能够有效的提高传感器的检测性能。 2. 原位合成可以使多种纳米材料组成一个有机体，能够更好的发挥其协同作用，从而使构建的生物传感器对其底物的检测能力有一定程度的提高。 关键词：位合成，纳米金，生物传感器 重庆医科大学硕士研究生学位论文 5 F Y F N is a of is by a 2 of ) in BL in 5% ML BL be an a of an in ML In we to a on in BL We of 庆医科大学硕士研究生学位论文 6 is to a 1. we as of in on of to 2. An of on as 2of 23. in we in on on 4. we of NA 5. of by of of BL as 庆医科大学硕士研究生学位论文 7 1. EM of on of of 0 2. on in 2of 2 107M 103M a 08M. of of 3. NA to BL of NA 1010a 101. EM in on 庆医科大学硕士研究生学位论文 8 2. in a of an a of BL in 庆医科大学硕士研究生学位论文 9 纳米金原位合成生物传感器的构建及其对慢性粒细胞白血病言 慢性粒细胞白血病(一种起源于造血干细胞的克隆性骨髓增殖性疾患，其特征是出现t(9;22)(位，即费城染色体(易位使9号染色体长臂(9的原癌基因2的大约95%以上的慢性粒细胞白血病患者细胞内有恒定的、特征性的，因此检测病进展预测、预后以及骨髓移植等治疗之后产生的微量残留白血病的诊断等都具有非常重要的临床意义5。 随着现代基因组学和分子生物学的发展，目前针对、荧光原位杂交(7、流式细胞仪检测(8、逆转录聚合酶链式反应(9、实时荧光定量 10等技术，染色体核型分析可以分析染色体在数量和形态上面的畸形，但要花费大量的时间和精力，并且灵敏度比较低；在实验过程中缺乏准确的定位；00个细胞，但只能在单个细胞水平上对细胞大小、形态等参数进行检测；是在实验过程中会导致很多的假阳性和假阴性，且很难用于定量分析；灵敏度和特异性都较高，但因其需要特殊的仪器且检测成本比较昂贵，不适合用于筛查和床旁诊断，因此，研究一种能够快速、灵敏、准确、便捷的方法用于慢性粒细胞白血病生物传感器11是一门融合多个学科和专业的新兴学科，它是将酶、抗原抗体和生物和细胞等生物材料固定到电极表重庆医科大学硕士研究生学位论文 10 面作为敏感材料，再和适当的换能器相结合，用于对不同的靶物质进行检测的新型器件12，目前在各个领域，如临床医学研究方面、食品和发酵工业方面、对环境检测等方面都已经有了比较广泛的应用。自3以来，利用建核酸的快速检测提供了一个快速、廉价的方法。 种于碱基之间的具有高度特异性的序列识别特性，在适当的温度、离子强度、冲溶液等杂交条件下，探针成而导致电极表面结构的变化，变化的情况可通过电极表面电活性改变所引起电信号(如电压、电流或电导)的变化体现出来，利用微分差异脉冲和循环伏安法测定杂交信号的变化，从而达到对临床上用于的选择性、价格低廉和适合联机检测等优点，在各种遗传性疾病、流行病学及肿瘤等疾病的检测和基因诊断方面有极大的应用价值14, 15。 随着现代纳米技术的发展，纳米材料在传感器中的应用越来越广泛。纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1或由它们作为基本单元构成的材料16,17，包括金属、氧化物、有机和无机物等。由于其特殊的纳米结构，具有比表面积大、吸附能力强、良好的导电性和生物相容性等特点，可以显著增强生物材料的负载量，并可以在一定程度上增加电极的电流信号响应强度，从而提高了检测的灵敏度，增大了线性范围。故将纳米材料和生物传感器相结合应用于靶分子的检测，可以提高生物传感器的性能。 纳米金是一种具有比表面积大、生物相容性好等优点的纳米材料，已经广泛用于传感器中各种生物材料的固定，如酶、抗原抗体、蛋白质、纳米材料在电极表面的固定过程是生物传感器构建中关键的步骤。已报道的文献中，很多纳米金的合成方法是利用枸橼酸钠还原法18，该方法合成纳米金在和其他纳米材料共修饰时不能充分发挥两种纳米材料的特性，因此我们迫切需要寻求一种方法实现纳米金在其他纳米材料表面的原位合成，实现纳米金和其他纳米材料的一体化，并用于构建电化学传感器。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 11 本研究中，我们利用壳聚糖对氯金酸的还原作用来实现纳米金在其他纳米材料表面的原位合成，并构建了将纳米金原位合成技术用于接下来的 物传感器的构建，用于慢性粒细胞白血病 方法在一定程度上联合应用了多种纳米粒子的特性，同时增加了纳米金的固定量，提高了电极表面探针高检测过程中的灵敏度和特异性，为进一步探索便捷、经济、快速、灵敏的检测手段有一定的研究意义。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 12 第一部分 原位合成纳米金技术构建生物传感器用于过氧化氢的检测 纳米金，是金的纳米微颗粒，具有高电子密度、节电特性和催化活性，能够与多种生物分子结合且不影响其生物学活性，故常常用于各种生物分子的固定，在生物传感器中也有着广泛的应用。目前已经报道了纳米金的多种制备方法，其中以柠檬酸盐作为还原剂的方法最为经典且应用最为广泛，但这些方法大都是基于纳米金的独立合成，然后再用于传感器的构建；本论文采用纳米金的原位合成和其他纳米材料联合应用，合成纳米材料复合物，并构建了1 材料和方法 验材料与仪器 化学工作站（荷兰海辰华仪器公司），国海雷磁仪器公司），本羧基化的多壁碳纳米管（径20 于成都有机化学研究所，氯金酸和硫堇购于聚糖和辣根过氧化物酶购于上海生物工程有限公司，所用的氯化钠、醋酸钠、铁氰化钾、冰醋酸、无水乙醇均为分析纯级别试剂，实验用水为超纯水。 验方法 庆医科大学硕士研究生学位论文 13 采用 o 等19和 20利用壳聚糖（氯金酸(简单绿色方法制备纳米金和体方法如下：v/v)的醋酸缓冲液中，制备0.5 壳聚糖溶液。取1 后加入1 温条件下超声分散，直到获得黑色均匀的混悬液。然后在制备的匀后在80水浴中振荡孵育1.5 h，然后取出，继续振荡至冷却到室温，然后转移到 4 冰箱中保存。所制备的混合物通过扫描电子显微镜进行表征。 氧化氢传感器的制备过程 将玻碳电极（直径为 3 后依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中各超声洗涤10 分钟，洗净晾干待用。然后在电极表面滴加 6 温条件下晾干成膜。然后将 入含 3 的硫堇醋酸缓冲液（.1 ，面，在 到+ (件下以 50 mV/s 扫描20圈，然后用超纯水，洗去非特异性吸附的硫堇溶液，室温条件下干燥。然后在电极表面滴加3 v/v = 1:1），4 干燥，即完成了 制备。该传感器性能的测定采用三电极系统，修饰过丝电极为对电极，米复合材料制备过程(A)和传感器制作过程(B) he A)B) 重庆医科大学硕士研究生学位论文 14 2 实验结果和讨论 极表面不同修饰物的电镜表征 饰EM A) CE B) 本课题利用扫描电镜对不同修饰物修饰电极进行表征（从图中(A)可以看到，合成的纳米金颗粒吸附在着大小为20 面利用壳聚糖实现了纳米金在（B）可以看到在修饰完过辣根过氧化物酶之后，表面呈现小的凹凸不平，在一定程度上扩大了加了酶的催化效果。 B 重庆医科大学硕士研究生学位论文 15 同组分在电极表面的电化学特性 u (同修饰成分在电极表面的循环伏安图：(a) 裸 (b) c) (d) 扫描速度：50 mV/s 测量条件（ 0.1 e(/e(溶液 of 0.1 e(/e( .1 50 mV/s. (a) (b) (c) d) .1 的e(/e(（含0.1 液中的循环伏安曲线。如图所示，和裸的玻碳电极相比，当电极表面仅修饰线b）和线c）条件下，分别引起电流响应信号强度的降低和升高；而在电极表面修饰 线 d），其产生的电流响应程度有了极大的提高，达到了最大值，这源于而增强了重庆医科大学硕士研究生学位论文 16 同修饰电极的电化学特性 (同修饰电极的循环伏安图：(a) 裸(b) (c) (d) 扫描速度：50 mV/s. 测量条件( 0.1 of .1 50 mV/s. (a) (b) (c) d) 的冲液中的循环伏安图像。如图所示，图其形较像仍然平滑，这源于够放大电流信号，增加电子传递，但因缺乏电子介体，故没有出现氧化还原峰；而在电极聚合硫堇之后（图c），可以看到电极表面出现一对氧化还原峰，电流响应程度较图源于硫堇是一种电子介体，可以有效的存进电子传递，同时借助这种电子传递作用进一步增强；图7 是蛋白质，可以阻碍电子的传递作用，从而导致电流较图 c 出现下降，这也表明了感器对过氧化氢的电化学响应 物传感器对过氧化氢电化学响应的循环伏安图：(a) 空白溶液；(b) 2.0 测量条件(0.1 扫描速度：50 mV/s. of at a 0 mV/s .1 (a) 2b) .0 传感器分别在空白的线a）和含有2.0 的过氧化氢溶液中（曲线b）做循环伏安扫描时，氧化峰和还原峰都比较对称，并且曲线是其还原峰电流较曲线说明在堇作为电子介体，促进电子的传递，出现了典型的面修饰到电极表面的作的传感器对过氧化氢具有良好的信号响应能力。 (i/ u A 8 同扫速条件下的传感器循环伏安特性 图 A）在不同扫描速度下的修饰电极的循环伏安曲线图；（B）氧化峰和还原峰电流与扫描速度的平方根的关系。测量条件：0.1 A): of at 0, 60, 80, 100, 120 40 mV/s .1 at (B): of on of )所示，在扫描速度从40 mV/mV/饰电极所得到的循环伏安曲线较对称，可逆性好。氧化峰电流且氧化峰电位和还原峰电位基本保持不变，这表明电极修饰复合膜在电子介体的辅助下能够很好的传递电子。)反映的是修饰电极的氧化峰电流和还原峰电流与扫描速度的平方根的关系，其线性方程分别为 + 图中可见，氧化峰电流和还原峰电流与扫描速度的平发根成正比，值接近于1，具有非常明显的扩散电流特征，这表明电极表面的电化学过程为扩散控制过程。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 19 感器的电化学响应特征、线性范围和检出限 A) 传感器在0.1 )缓冲液中连续加入50 B)传感器测定过氧化氢的电流和浓度的标准曲线 A) of to 2a .1 ) an (B) 2在最佳的实验条件下，我们采用时间过在底物溶液中连续加入制作其电流和对应过氧化氢浓度的标准曲线。A)所示，随着过氧化氢的不断加入，该传感器对过氧化氢的响应明显，电流随着过氧化氢的加入，传感器的响应电流明显增大，且响应速度快。B)的标准曲线可知，图条件下，测定的传感器的标准曲线，从曲线可知，过氧化氢浓度在5107 03范围内和响应电流呈线性关系，08。表明该传感器具有较好的检测灵敏度。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 20 2.7 同pH of 硫堇是一个不同的发生传递电子的过程，这一过程主要是发生了两个电子的转移和一个质子的产生，该变化过程如下图所示21, 22： 液的此缓冲液的此我们考察了醋酸缓重庆医科大学硕士研究生学位论文 21 传感器在电流响应信号最大。因此，我们采用3 小结 本研究中我们利用壳聚糖对氯金酸的还原作用，实现纳米金在对其进行表征，然后利用所制备的果显示，该传感器综合利用了我们进一步利用该技术构建重庆医科大学硕士研究生学位论文 22 第二部分 纳米金原位合成生物传感器对慢性粒细胞白血病第一部分的研究中，我们利用壳聚糖作为还原剂，在利用扫描电镜对复合材料进行表征；纳米材料复合物构建的性范围宽，检测下限较低。在这一部分，我们将利用纳米金的原位合成技术和于慢粒的1 材料和方法 验材料与仪器 化学工作站（荷兰海辰华仪器公司），国海雷磁仪器公司），本羧基化的多壁碳纳米管（径20 于成都有机化学研究所，二氧化铈(圆球形，直径20 于北京纳米材料科技有限公司，氯金酸和亚甲蓝(于聚糖购于上海生物工程有限公司，所用的氯化钠、醋酸钠、铁氰化钾、冰醋酸、无水乙醇均是分析纯级别，实验用水为超纯水。 料 利用据同源比对选择位点附近的特异性的18个碱基作为探针人工合成使用，主要涉及的5端巯基化标记的探针1: 5重庆医科大学硕士研究生学位论文 23 靶5单碱基错配序列55以上所列碱基序列均由上海生物工程有限公司合成。 液配制 （1）2）10 .0 制，并用 10 至 （3）合成的打开时极易散失，故溶解前，首先将装有离心10 后慢慢打开盖子，根据说明书要求加入适量体积的的配制成浓度为100而盖上管盖并上下振摇5 时为了避免反复冻融，可将储备液分装后，冷冻保存，使用前取出 4 稀释使用。 （4）不同浓度的冲液稀释即可。 （5）冲液配置20 液中含有50 验方法 （1）米金的原位合成原理同第一章所描述的，利用9和0利用壳聚糖（氯金酸(简单绿色方法来完成纳米复合物的制备，具体方法如下：v/v)的醋酸缓冲液中，制备1 壳聚糖溶液。然后加入5 氧化铈(米粒子，室温条件下超声