生物工程教案及讲稿VIP

1生物工程教案及讲稿课程名称 生物工程总学时数 36 理论学时 27 实验学时 9 学 分学科基础课（ ） 专业核心课（ ） 注：在选中的括号中打钩即可课程类型 专业选修课（ ） 公共基础课（ ） 注：在选中的括号中打钩即可考核方式 考试（ ） 考查（ ） 注：在选中的括号中打钩即可是否采用多媒体 采用 是否采用双语教学 否教材名称 生物工程概论第二版教材作者 利容千所用教材出版社及出版时间 华中师范大学出版社，2007名称 作者 出版社及出版时间生物工程概论 陶兴无 化学工业出版社， 2005现代生物工程导论 贺小贤 科学出版社， 2005生物工程导论 岑沛霖 化学工业出版社，2004参考书目2第 1 讲 第 1 次课， 2 课时 章、节名称 第一章 绪论教学目的与教学要求本章从生物技术的定义、发展历史、现代生物工程的基本内容、当代生物技术的应用概况等方面，深入浅出地介绍了生物工程的基础知识，使学生对近代及当代的生物技术发展有所了解，提高他们刻苦学习专业知识，完善自己的知识结构，为建设祖国而奋斗的自觉性和积极性。教学重、难点【 教学重点 】生物技术和生物工程；生物工程和其他学科的关系；生物工程的基本内容；生物工程在各行各业的应用【 教学难点 】现代生物技术带来的问题教 学 方 法 讲授加板书、多媒体教学教 学 内 容第一章 绪论一 生物技术的概述二 生物工程的内容三 现代生物技术的应用和研究热点四 现代生物技术带来的问题同学们大家好。大家都知道每次社会经济的飞跃都伴随着某种革命，第一次工业革命发明了什么？（蒸汽机和纺纱机）解放了人的双手；第二次技术革命是什么？（信息技术）扩展了人的大脑；那么我们现在的社会正在发生新的变革。随着人类对自身和生物的了解日益加深，改造自身和获得新生物的愿望也越来越迫切。也就有了第三次技术革命（生物技术） 生物技术将是未来经济发展的新动力。为什么这么说？当今人类社会面临最重大的问题和挑战人口膨胀；粮食短缺；疾病危害；环境污染；能源危机；资源匮乏；生态平衡破坏；生物物种大量消亡。解决人类生存与发展所面临的一系列重大问题，在很大程度上将依赖于生命科学的发展。生命科学对人类经济、科技、政治和社会发展的作用是全方位的。一 什么是生物技术1982 年，国际合作与发展组织(ICDO)对生物技术进行了定义：即应用自然科学及工程学原理，依靠微生物、动物体、植物体作为生物发应器，将原料加工以提供产品来为社会服务的技术。美国政府技术顾问委员会(OAT) 的定义：应用生物或来自生物体的物质制造或改进一种商品的技术，其还包括改良有重要经济价值的植物与动物和利用微生物改良环境的技术。1 定义：是以现代生命科学理论为基础，利用生物体及其细胞的、亚细胞的和分子的组成部分，结合工程学、信息学等手段开展研究及制造产品，或改造动物、3植物、微生物等，并使其具有所期望的品质、特性，从而为社会提供商品和服务的综合性技术体系。生物工程定义： 以现代生命科学为基础, 把生物体系与工程学技术有机结合在一起，按照预先的设计，定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料, 产生对人类有用的新产品(或达到某种目的 )之综合性科学技术。特征： 21 世纪最具潜力的高新技术多学科、交叉、综合的技术影响最为深远最广泛的技术2 分类：（1）传统生物技术传统生物技术主要是指通过微生物的初级发酵来生产产品的技术。如酱油、酒、面包、酸奶及其它发酵食品的传统工艺.它包括三个重要的步骤：第一步：上游处理过程。所谓上游过程，是指对于粗材料进行加工，作为微生物的营养和能量来源；第二步：发酵和转化。发酵指的是目的微生物的大量生长发酵过程必须在一个大的生物反应器内进行，反应器容积通常大于 lOO L，可以连续生产某一个目的产品；第三步：下游处理过程。主要是指所需目的产物的纯化过程，人们既可以从细胞的培养液中纯化，也可以直接从细胞中纯化。纯化方法包括蒸馏、萃取、结晶、干燥、过滤等。（2）现代生物技术：现代生物技术是在 20 世纪 70 年代于细胞遗传学和分子生物学基础上发展起来的以基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程等为主要研究内容的技术体系。 在现代高新技术领域中，它与信息技术、新材料科学并列为当今三大前沿科学，并且占据着更重要的地位。3 生物技术与生物工程的关系生 命 科 学 原 理生 命 科 学 原 理生 物 化 学微 生 物 学细 胞 生 物 学分 子 遗 传 学工 程 技 术工 程 技 术 生 物 工 程生 物 工 程物 理 、 化 学 工 程 、数 学 、 计 算 机 技术 、 信 息 学 等物 理 、 化 学 工 程 、数 学 、 计 算 机 技术 、 信 息 学 等生 物 技 术 的 大规 模 产 业 化生 物 技 术 的 大规 模 产 业 化生 物 技 术 与 生 物 工 程 的 关 系生 物 技 术 与 生 物 工 程 的 关 系生 物 技 术 和 生物 工 程 的 区别 ？生 物 技 术 和 生物 工 程 的 区别 ？4二 生物工程的内容1 基因工程：基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的 DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商业价值。基 因 工 程 技 术 及 其 应 用供 体 细 胞 目 的 基 因载 体 重 组 DNA分 子转 化 细 胞受 体 细 胞多 肽 药 物疫 苗 、 抗 体基 因 治 疗基 因 诊 断 转 基 因 动 物(畜 牧 业 、 渔 业 生 物 反 应 器 )转 基 因 植 物(农 业 、 林 业 生 物 反 应 器 )冶 金 、 环 保轻 工 、 食 品2 蛋白质工程“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代” ，即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终获得商业化的产品。3 酶工程是酶学与工程学的相互渗透和结合所发展起来以酶为研究对象，改造并应用酶的特异催化功能。目标就是通过工程化技术大规模生产和转化相应原料成为有用物质的技术。传统的酶工程主要是指天然酶制剂在工业上的大规模生产与应用。随着科学的发展，尤其是基因工程技术的日趋完善，为酶工程赋予了新的内容，特别是利用 DNA操作技术，修饰改造酶分子的结构或活性位点、酶与底物作用位点，重组酶的生产，模拟酶的人工设计与合成等成为新的内容。4 细胞工程利用工程学原理进行细胞生物学的基础研究和制造使用活细胞的产品，如组织工程和生物加工工程。前者是利用移植的细胞、骨架、DNA 、蛋白质或蛋白质片段替代或修复已受伤或损坏的组织和器官；后者是 利用活细胞生产生物医药产品。5 发酵工程现代发酵工程主要指利用微生物、包括利用 DNA 重组技术改造的微生物在全5自动发酵罐或生物反应器中生产某种商品的技术。现代发酵工程是生物代谢、微生物生长动力学、大型发酵罐或生物反应器研制、化工原理等密切结合和应用的结果。基因工程是核心 ，带动其他四大工程的发展，四大工程的发展又促使基因工程发展更迅猛。基因工程和细胞工程看作生物工程的上游处理技术，将发酵工程和酶工程看作生物工程的下游处理技术。基因工程、细胞工程和发酵工程中所需的酶往往是通过酶工程来获得的。 三 现代生物技术的应用和研究热点1 医药：生物制药；基因治疗；人工器官2 农业和畜牧业转基因植物：抗病虫害新品种、抗逆新品种、 高品质新品种 转基因动物：生产有用蛋白质和高品质的畜产品生物反应器：利用动植物细胞或组织作为生物反应器，直接生产有用蛋白质3 轻工与食品新型食品；营养食品；保健食品；轻工用酶 4 环境污染治理；废物利用；污染物生物降解5 特点：(八高一低)四现代生物技术带来的问题1 经过基因改造的生物或生物产品是否会对其他生物体和环境造成危害？2 开发和使用基因工程药物是否会降低自然界的生物多样性？ 3 人是否也可以成为基因工程操作的对象？4 基因诊断的程序是否会侵犯个人隐私权？5 用现代生物技术生产的药物进行治疗是否会压抑同样有效的传统治疗方式6 农业生物技术是否会彻底改变传统的耕作方式？7 现代生物技术专利的申请是否会阻止科学家之间自由的学术思想交流，影响宗教和文化68 现代生物技术能否有效对付严重危害和威胁人类健康与生命安全的传染性疾病？作业、讨论题、思考题：什么叫做生物工程？按照研究对象，生物工程包括哪些方面？7第 2 讲 第 2 次课， 2 课时 章、节名称 第二章 基因工程教学目的与教学要求 熟悉基因的基本概念、性质，掌握基因的功能，了解基因工程的诞生背景教学重、难点【 教学重点 】基因的结构、功能，DNA 双链的性质，遗传信息的传递法则【 教学难点 】导致基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大突破教 学 方 法 讲授加板书、多媒体教学教 学 内 容第二章 基因工程第一节 基因的基本概念一 什么是基因二 基因的结构三 基因的功能第二节 基因工程的概述一 基因工程的诞生上节课过渡到本次课的内容一 什么是基因基因（Gene,Mendelian factor）是指携带有遗传信息的 DNA 或 RNA 序列，也称为遗传因子，是控制性状的基本遗传单位。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。孟德尔发现了遗传因子：（1）生物性状的遗传由遗传因子决定（遗传因子后来被称为基因） 。 （2）遗传因子在体细胞内成对存在，其中一个成员来自父本，另一个成员来自母本 （3）遗传因子符合自由组合规律二 基因的结构（复习）1 核酸的化学组成（包括 DNA 的化学组成、脱氧核苷酸的分类）2 DNA 的分子结构3 基因的结构（1） 基因的三个特性基因可以自我复制基因决定性状8基因可以突变（2 ）分类：结构基因：一条基因决定一条多肽链调控基因：调节控制结构基因表达原 核 细 胞 的 基 因 结 构原 核 细 胞 的 基 因 结 构编 码 区编 码 区 非 编 码 区非 编 码 区非 编 码 区非 编 码 区编 码 区 上 游编 码 区 上 游 编 码 区 下 游编 码 区 下 游调 控 遗 传 信 息 的 表 达调 控 遗 传 信 息 的 表 达(调 控 序 列调 控 序 列 )编 码 蛋 白 质编 码 蛋 白 质(编 码 序 列编 码 序 列 )真 核 细 胞 的 基 因 结 构真 核 细 胞 的 基 因 结 构编 码 区编 码 区 非 编 码 区非 编 码 区非 编 码 区非 编 码 区编 码 区 下 游编 码 区 下 游调 控 遗 传 信 息 的 表 达调 控 遗 传 信 息 的 表 达(调 控 序 列调 控 序 列 )外 显 子外 显 子(能 编 码 蛋 白 质能 编 码 蛋 白 质 ) 内 含 子内 含 子(不 能 编 码 蛋 白 质不 能 编 码 蛋 白 质 )三 基因的功能1 携带遗传信息：从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。92 基因的复制DNA的 复 制边 解 旋 边 复 制半 保 留 复 制遵 循 碱 基 互 补 配 对 原则双 向 复 制3 基因的表达基 因 对 性 状 的 控 制1.通 过 控 制 蛋 白 质 分 子 的 结 构 来 影 响 性 状2.通 过 控 制 酶 的 合 成 来 控 制 代 谢 过 程 ， 从而 控 制 生 物 性 状蛋 白 质DNA mRNA上 上 上 上 上 -上 上 上 上 上 上 上 上 上转 录转 录 表 达表 达由 DNA 控制的蛋白质合成涉及两个基本过程：第一步，DNA 的遗传信息转录到 mRNA 中，发生在细胞核中；第二步，将 mRNA 的信息翻译成蛋白质的氨基酸序列，在细胞质中进行。原核生物中遗传信息的转录和翻译则简单一些简单回顾下原核和真核生物基因转录翻译的不同10第二节 基因工程的概述一 基因工程的诞生导致基因工程诞生的是分子生物学领域的理论上的三大发现和技术上的三大发明理论上的三大发现：基因的物质基础是 DNA、DNA 的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码子的破译技术上的三大发明：工具酶的发明、载体、逆转录酶有了这些理论核技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg 和 Cohen 两位科学的“助产士 ”，把基因工程接到了人间。我们应该记住他们1.第一个实现 DNA 重组的人Berg1972 年，Berg 用 E.coR切割 SV40DNA 和 phageDNA，经过连接组成重组的 DNA 分子。Berg 是第一个实现 DNA 重组的人。2.第一个取得基因工程成功的人Cohen1973 年，Cohen Group 将 E.coli 的 tetr 质粒 psclol 和 nersrR6-3 质粒体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化 E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrNer,实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子，这一年被定为基因工程诞生的元年。作业、讨论题、思考题：基因工程诞生时理论上的三大发现和技术上的三大突破是什么？11第 3 讲 第 3 次课， 2 课时 章、节名称 第二章 基因工程教学目的与教学要求了解基因工程的概念、特点和意义，熟悉基因工程的步骤，掌握 PCR 法和限制性内切酶的特点教学重、难点【 教学重点 】基因工程的本质、特点，基因工程的步骤，目的基因的获取方法，基因工程中主要的工具酶【 教学难点 】基因工程的操作步骤，目的基因的合成，如 PCR 法，工具酶的功能和应用教 学 方 法 讲授加板书、多媒体教学、放视频教 学 内 容第二节 基因工程的概述二基因工程的概念三基因工程的特点和意义第三节基因工程的操作一 基因工程的步骤二 目的基因的分离和合成三 基因工程工具酶二 基因工程的概念基因工程：在生物体外，通过对 DNA 分子进行人工“剪切”和“拼接” ，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。基因工程的别名 基因拼接技术或 DNA 重组技术操作环境 生物体外操作对象 基 因操作水平 DNA 分子水平基本过程 剪切拼接导入表达结果 人类需要的基因产物实质 基因重组12三 基因工程的特点和意义1 特点：跨物种性-外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。如人的胰岛素基因可以转移到大肠杆菌上表达。无性扩增-外源 DNA 在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。2 意义：基因工程是按照人的意志定向培育生物新品种、新类型乃至创造自然界从未有过的新生物的最佳途径。基因工程是现代新技术革命的标志第三节 基因工程的操作一 、基因工程的步骤在体外通过人工剪、接，将不同来源的 DNA 分子组成一个杂合 DNA 分子(DNA分子重组体)，然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程。由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。 四个基本条件：目的基因、工具酶、载体、受体细胞 五 个 基 本 步 骤 ：五 个 基 本 步 骤 ：1 提 取提 取 目 的 基 因目 的 基 因2 获 取获 取 基 因 载 体基 因 载 体3 目 的 基 因目 的 基 因 与 运 载 体 结 合与 运 载 体 结 合4 将 目 的 基 因将 目 的 基 因 导 入导 入 受 体 细 胞受 体 细 胞5 目 的 基 因 的目 的 基 因 的 检 测检 测 和和 表 达表 达一 、 基 因 工 程 的 步 骤上 上 酶酶二 目的基因的分离与合成1 提取目的基因的方法（一）：直接分离基因鸟枪法将供体生物的 DNA 用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去2 提取目的基因的方法（二）：反转录法以目的基因转录成的信使 RNA 为模板，反转录成互补的单链 DNA，然后在酶的作用下合成双链 DNA，从而获得所需的基因。133 提取目的基因的方法（三）根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使 RNA 序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。优点 缺点鸟枪法 操作简便广泛使用 工作量大，盲目，分离出来的有时并非 一个基因反转录法 专一性强 操作过程麻烦，mRNA 很不稳定，要求的技术条件较高根据已知氨基酸合成 DNA 法 专一性最强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因4 人工合成-PCR 技术原理及反应过程原理：DNA 双链复制反应过程：加热至 9095 ，目的基因 DNA 解链冷却至 5560 ，引物结合到互补 DNA 链加热至 7075 ，热稳定 DNA 聚合酶从引物起始互补链的合成。 三 基因工程工具酶哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？1）DNA 序列自动测序仪2）PCR 技术141 基因的剪刀限制性内切酶（简称限制酶）限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，能将外来的 DNA 切断，由于这种切割作用是在 DNA 分子内部进行的，故名限制性内切酶。特点：特异性。即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割 DNA 分子。意 义 不 大非 常 有 用无 用在 基 因 工程 中 意 义相 距 5-10bp同 一 位 点分 别 ， 随 机 切割 ， 相 距 较 远识 别 与 切割 位 点双 功 能单 一 功 能单 一 功 能限 制 和 修饰 活 性 型 型 型特 性限 制 性 核 酸 内 切 酶 的 分 类限 制 性 核 酸 内 切 酶 的 分 类限 制 性 核 酸 内 切 酶 的 分 类限制酶的识别位点一般特征（4 点）：（1）型酶识别的特殊 DNA 序列称为限制酶的识别位点（或切割位点） 。（2）它能识别 dsDNA 的 46bp（碱基对）的回文序列并水解该部分的核苷键。一般来说是 46bp，有 6 个以上的，但没有 4 个以下的。（3）识别顺序呈二重对称(回文结构 )，即 180 度旋转对称。如：GC CG GTNAC GAA TTCHha CG GC Mae CANTG EcoR CTT AAG(4) 特异性限制酶的切割位点：限制性对 dsDNA 2 条链同时切割（其具体切割点，即磷酸二酯键断开的位点，相对二重对称轴的位置而异）产生 3 种不同切口：1 形成平头末端（flush 或 bluntend）如TCGA- smabsuR or TC3+5 GA-AG CT- Alu -AG5+3CT-2.形成 5粘性末端 （5 cohesive end 即 3延伸末端）5-GAATTC3EcoR 5-G AATTC-3+3-CTTAAG5 3-CTTAA G-53.形成 3粘性末端（3 cohesive end）思考：基因工程培育抗虫棉的简要过程：上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？155CTGCAG 3 pst G-3 5-CTGCA+3GACGTC 5 ACGTC-5 3-G粘性末端（sticky end）被限制酶切开的 DNA 两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端2 基因的针线DNA 连接酶DNA 连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的 DNA 分子就形成了。DNA 连接酶是 1967 年在三个实验室同时发现的，最初是在大肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭 DNA 链上缺口酶，借助 ATP 或 NAD 水解提供的能量催化 DNA 链的 5-PO4 与另一 DNA 链的 3-OH 生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T 4DNA 连接酶除外)，而且必须是两条紧邻 DNA 链才能被 DNA 连接酶催化成磷酸二酯键。 3 其他工具酶Taq DNA 聚合酶：75-80 ，主要用于 PCR 扩增及 DNA 序列测定。逆转录酶：mRNA cDNA 主要用于组建 DNA 文库。T4 多核苷酸酶主要用于制备杂交探针及测序引物的 5磷酸标记作业、讨论题、思考题：1 简述限制性内切酶和 DNA 连接酶的作用机制2 如何采用 PCR 技术从生物材料中分离出目的基因？16第 4 讲 第 4 次课， 2 课时 章、节名称 第二章 基因工程教学目的与教学要求掌握基因工程的载体的类型、功用和构建，熟悉基因导入受体细胞的方法，了解基因工程的应用和发展教学重、难点【 教学重点 】载体应具备的条件，质粒载体和噬菌体载体的特点，目的基因导入细胞的方法【 教学难点 】结合理论了解基因工程的应用教 学 方 法 讲授加板书、多媒体教学教 学 内 容第三节 基因工程的操作四 基因工程载体五 目的基因导入受体细胞第四节 基因工程的应用和发展四 基因工程载体1 定义：将外源 DNA 或基因携带入宿主细胞的工具称为载体。简言之，就是基因的运载工具。功能：运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体应具备的条件：1）.在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）2）.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，供外源 DNA 片断插入，同时不影响复制3）.有一定的选择标记，用于筛选4）.具有较高的拷贝数，便于载体的制备目前常用的载体有质粒载体（plasmid） 噬菌体载体和病毒载体2 质粒：是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的 DNA 分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的 DNA 分子。质粒是基因工程最常用的运载体。绝大多数细菌质粒都是闭合环状 DNA 分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。通过重组克隆的 “插入失活”来进行筛选 17pBR322插入在 Tetr 中，基因型为 Tets 、Ampr在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长；pBR322插入在 Ampr 中，基因型为 Tetr 、Amps、在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培养基可生长；而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个基因位点中插入外源 DNA 片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。 3 噬菌体载体（1）线状双链 DNA 分子，全长 48.502kb。（2）.两端的 5末端具有 12 碱基的突出互补的粘性末端（cohensive end，cos） ，该末端称为 cos 位点。可被 编码的 A 蛋白所识别（3）.当 侵入宿主细胞后，线状 DNA 分子借助粘性末端连接成环状分子 噬菌体的改造 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb 或更大） ； 去掉太多的酶位点，每种酶只留 1-2 个切口； 增加标记基因；(4) 引入无义突变。4 人工染色体克隆载体人工染色体载体又叫大分子 DNA 克隆载体，利用染色体的复制元件来驱动外源DNA 片段复制的载体。其装载外源 DNA 片段的容量可以与染色体的大小媲美。用来克隆大片段的 DNA，不做常规克隆使用。五 目的基因导入受体细胞1 常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。2 转化途径：转化法 1）将细菌用 CaCl2 处理，以增大细菌细胞壁的通透性。2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。基因枪法：将待转化的 DNA 沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直接打入动植物细胞，枪的威力为 430 m / s显微注射法通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌鼠，从其输卵管内取出受精卵；借助于显微镜将纯化的 DNA 溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄性原核内。上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操作，所以不太适用于基因的克隆和表达。花粉管导入法：将外源 DNA 沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移。这一方法是我国科学家周光宇首先提出设计的，目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。花粉管导入法的特点是直接、简便。它的受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍，特别适合于难以建立有效再生系统的植物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，导入的DNA 分子整合效率较高。18第四节 基因工程的应用和发展一、基因工程在农业生产中的应用二、基因工程在工业中的应用三、基因工程在医药上的应用四、基因工程在环境保护中的应用五 基因工程技术的商业化发展作业、讨论题、思考题：1 基因克隆载体至少应具备哪些特点?2 选择受体细胞重点考虑哪几点？3 简述外援基因转入受体细胞的各种途径。19第 5 讲 第 5 次课， 2 课时 章、节名称 第三章 发酵工程教学目的与教学要求 掌握什么是发酵的基本概念，熟悉发酵过程，了解发酵工程的发展史教学重、难点【 教学重点 】什么是发酵，发酵的工业过程【 教学难点 】现代生物技术带来的问题教 学 方 法 讲授加板书、多媒体教学教 学 内 容第一节、发酵工程概述一、发酵工程的定义二、发酵工程的应用范围三、微生物发酵技术的发展历史四、发酵过程的组成部分第二节、发酵设备与基本工艺过程一 发酵设备二 发酵工程基本工艺(一）菌种的选育（二）培养基的配制从上节课内容引到本节课第一节、发酵工程概述一 发酵工程的定义（一）什么是发酵？1 传统意义的发酵“发酵”（Fermentation）一词是拉丁语“沸腾”（fervere ）的派生词。它描述酵母作用于果汁或麦芽浸出液时产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。 酵母无氧条件下的呼吸过程：产生气泡的现象是由浸出液中的糖在缺氧条件下降解而产生的二氧化碳所引起的。2 生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。指葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出 CO2。3.工业上的发酵（现代意义上的发酵）泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程。20厌氧培养的生产过程：酒精、乳酸等通气（有氧）培养的生产过程：抗生素、氨基酸、酶制剂等产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等（二）发酵工程的定义利用微生物的特定性状和机能，通过现代化工程技术，生产有用物质或直接应用于工业化生产的一种技术体系；是将传统的发酵技术与现代的基因工程、细胞工程、代谢工程、生物信息工程和计算机控制等新技术结合并迅速发展的现代发酵技术。（三）发酵工程的特点1 原料特点：广泛、粗放、经济2 微生物细胞特点：（1）细胞工厂，可从单一发酵设备中一次合成（2）代谢复杂性，所需产品无论多么复杂，可合成复杂产物（3）酶促反应的高选择性，手性转化，附加值高、具有重大经济价值的物质（4）生物多样性，微生物种类多，微生物的特定性状和性能，通过传统和现代技术发现，调控某一特性3 与化学工程相比（1）发酵过程常温常压下，一般不用考虑防暴问题（2）发酵过程是纯培养过程，防止杂菌污染，生产过程所需的设备、培养基和空气都需进 行严格的无菌处理，一旦杂菌侵入就有可能导致发酵生产的失败。（3）微生物发酵液成分较复杂，其产品分离与纯化过程比化学反应过程复杂得多。（4）微生物菌体也是发酵产物，微生物细胞富含蛋白质、核酸、维生素等有用物质。微生物发酵液一般不含对生物提有害的物质4 与其他学科的关系二 发酵工程的应用范围1 以微生物细胞为产物的发酵工业生产制作面包的酵母菌; 生产作为人类或动物食物的微生物细胞（即单细胞蛋21白质）2 以微生物代谢产物为产品的发酵工业当微生物进入稳定期后，代谢产生如氨基酸、核苷酸、脂类和碳水化物以及抗生素等多种初级和次级代谢产物。 3 生物转化或修饰化合物的发酵工业生物细胞或其产生的酶能将一种化合物转化成化学结构相似，但在经济上更有价值的化合物。转化反应包括催化脱氢、氧化、羟化、缩合、脱羧、氨化、脱氨化等作用。4 微生物废水处理和其他三 微生物发酵技术的发展历史1 传统（古老）发酵技术只知其然不知其所以然的经验活动原始人类古埃及人在公元前 40 世纪时开始用经发酵的面团制作面包，公元前 40 世纪已掌握了用裸麦制作啤酒的技术公元前 25 世纪古巴尔干人开始制作酸奶公元前 20 世纪古亚述人已学会葡萄酿酒公元前 17 世纪古西班牙人曾用类似目前细菌浸取铜矿的方法获取铜我国传统发酵的历史同样悠久，用黏高粱（秫）造酒始于第一个奴隶制朝代-夏代的初期（迄今约 4000 年）2 近代发酵技术的建立（纯培养技术的建立）微生物纯培养技术的建立，开创了人为控制微生物的时代，密闭式发酵罐人工控制环境条件的发酵系统，逐渐建立了丙酮、丁醇、甘油、酒精、有机酸、固体酶制剂等工业，至 20 世纪 20 年代，近代发酵工业已基本形成。在近代发酵工业中，主要的发酵产品为饮料酒、有机溶剂和多元醇等厌氧发酵产品，有机酸、粗酶制剂（包括中国的酒曲）等好氧微生物的发酵培养则主要采用固态培养法和表面培养法3 发酵工业第二个转折期：通风搅拌技术4 发酵工业第三个转折期：人工诱变育种与代谢控制技术5 发酵工业第四个转折期：基因工程技术四 发酵过程的组成部分典型的发酵生产过程包括：确定菌种繁殖和发酵生产所用的培养基；对培养基、发酵罐及其附属设备进行灭菌；菌种经逐级扩大培养后，作为生产种子接种于发酵罐中；控制发酵罐中微生物的生长条件，最大程度地获得预期的代谢产物；产物萃取和精制；发酵过程中废弃物的处理与回收。第二节 发酵设备与基本工艺过程一 发酵设备发酵罐是供微生物在灭菌后的培养基中进行生命活动和代谢的设备。它必须能够提供微生物生命活动和代谢所要求的条件，并便于操作和控制，保证工艺条件的实现，从而获得高产。22二 基本工艺(一）菌种的选育要想通过发酵工程获得在种类、产量和质量等方面符合人们要求的产品，最重要的是要有优良的菌种。1 工业上常见的菌种从自然界中分离出来就能被利用； 对野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。使用重组 DNA 技术改造的菌株目前育种总趋势从野生菌转向变异菌自然选育转向代谢育种从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。2 菌种的选育工业生产中微生物育种的基本方法包括自然选育、诱变育种、抗性菌种选育、代谢控制育种及基因重组定向育种等。育种就是要改善菌种的特性，使之能提高产量、改进质量、降低成本、改进工艺、方便管理及综合利用等。 代谢控制育种主要有两个方面：改变代谢通路的育种改变代谢自动调节系统的育种A、自然选育B、诱变育种（二）培养基的配制1 培养基的营养成分（1）能源（2）碳源（3）氮源 (4)无机盐（5）特殊生长因子2 培养基的用途筛选菌种保藏菌种检验杂菌培养种子发酵生产3 培养基的分类（1）按培养基组成物质的化学成分：合成培养基、天然培养基。（2）按物理性质：固体，液体（3）按用途：选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基等4 发酵生产中的培养基类型工业发酵中培养基往往是依据生产流程和作用分为：斜面培养基种子培养基发酵培养基摇瓶培养基5 培养基的选择(1)必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。(2)有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大23产率。(3)有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。(4)有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。(5)尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。(6)原料价格低廉，质量稳定，取材容易。(7)所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。(8)有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。6 培养基的配制（1）首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求既有共性，也有各自的特性，应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。（2）提供必要的营养成分：培养基成分必须满足细胞生长，代谢活动和合成产物所需的基本要求。（3）配制合适的浓度：可以从发酵动力学有关生长、产物合成和基质利用物料平衡的关系中大致推算所需原料或大致计算出所需主要原料的需要量。（4）主成分与其他成分的配比。（5）控制合适的 pH：微生物的生长繁殖或产物的合成往往需要定的 pH 环境，在最适 pH 值下有利于加快各种酶的反应。因此在整个发酵过程中应使培养基的pH 适合于微生物生长或产物合成所需。（6）注意代谢调节物的影响：有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成。前体物质诱导剂阻遏物抑制剂金属离子（7） 金属离子的影响：有些种类的发酵生产对金属离子相当敏感，因为有些金属离子是中间代谢酶的抑制剂或激活剂。因此对于有重大影响的金属离子必须严格控制。如柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量，钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用，而钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的，这些在培养基配制时都必须予以注意。作业、讨论题、思考题：发酵的一般步骤有哪些？24第 6 讲 第 6 次课， 2 课时 章、节名称 第三章 发酵工程教学目的与教学要求掌握发酵工程的灭菌技术，熟悉发酵过程的操作方式，了解发酵产品的分离纯化过程教学重、难点【 教学重点 】发酵工程的灭菌技术【 教学难点 】发酵过程的操作方式教 学 方 法 讲授加板书、多媒体教学教 学 内 容第二节 发酵设备与基本工艺过程二 发酵工程基本工艺（三）培养基和设备的灭菌（四）扩大培养和接种（五）发酵过程（六）产品的分离提纯第三节、发酵过程的现状与展望一 应用现状二 发酵工程的发展趋势从上节课引入到本节课内容（三）培养基和设备的灭菌是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。灭菌与消毒的区别灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。灭菌的目的：在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果：生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难杂菌会降解目的产物；25杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。培养基灭菌的要求（1）达到要求的无菌程度（10-3）（2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。灭菌的方法（1）化学法 化学药品灭菌法 （2）物理法 干热灭菌法 湿热灭菌法射线灭菌法 1 培养基灭菌培养基的灭菌有分批法和连续法两种。分批灭菌是将配制好的培养基放入发酵罐中，通入蒸汽，使培养基和所有设备一起灭菌。这一过程也称为实罐灭菌。连续灭菌是在配制好的培养基向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却，完成整个灭菌过程。连续灭菌时间短，灭菌温度一般高于分批灭菌，所以可减少对营养物质的破坏，灭菌效果优于分批式，但灭菌设备较复杂，投资大，而且所有设备须事先进行空罐灭菌，如发酵罐、加热器、维持罐、冷却器等。2 空气灭菌微生物在好氧性发酵过程中一般是以空气作为氧源，被通入发酵系统。但空气中含有多种微生物，这些微生物一旦随着空气进入发酵系统，它们也会大量繁殖，不仅消耗大量的营养成分，还可能产生各种各样的代谢产物，影响和破坏发酵的正常进行，危害极大。因此，空气必须经过除菌后才能通入发酵液。3 发酵罐的灭菌培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发酵罐应在加入灭菌的培养基前先行单独灭菌。通常是用蒸汽加热发酵罐的夹套或设管并从空气分布管中通入蒸汽，充满整个容器后，再从徘气管中缓缓排出。容器内的蒸汽压力保持 1 公斤，20 分钟。在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压，防止形成真空而吸入带菌的空气。4 补料液的灭菌在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属设备和管道都要经过灭菌。（四）扩大培养和接种1 发酵工业的种子制备26作为发酵工业的种子应具备以下条件：菌种细胞的生长活力强；菌种生理状态稳定；菌种浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求；无杂菌污染；菌种适应性强。种子培养是指将冷冻干燥管、沙土管中处于休眠状态的工业菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。2 扩大培养和接种 Q1 如何得到发酵生产所需要的大量菌体来缩短生产周期呢？经过多次的扩大培养。Q2 如何对菌种进行扩大培养呢？扩大培养是将培养到对数期的菌体分开，分头进行培养，以促使菌体数量快速增加，能在短时间里得到大量的菌体。Q3 扩大培养与发酵生产过程中的培养有何不同呢？扩大培养是为了让菌体在短时期内快速增殖，而发酵过程中的培养是为了获得代谢产物，目的不同采用的培养条件就有可能不同。例如：在酒精发酵过程中，扩大培养是为了促使酵母菌快速增殖，因此是在有氧条件下进行。而在发酵产生酒精的过程中则必须在无氧条件下进行以获得大量的酒精Q4 有了用于生产的充足的菌体，在接种时要注意什么事项呢？接种过程中要注意防止杂菌污染。在发酵罐冷却后，才可加入菌种。 （五）发酵过程控制Q:将菌体接种到装有培养液的发酵罐中，还需要对发酵过程进行检测和对发酵条件进行控制。这是为什么呢？发酵产物主要在菌体生长的稳定期产生。因此，要在发酵过程中随时取样检测培养液中细菌数目、产物浓度以了解发酵进程，及时添加必需的培养基成分来延长菌体生长稳定期的时间，以得到更多的发酵产物。同时，还应对发酵条件进行严格控制。 1 温度对发酵的影响及其控制（1）影响发酵温度的因素（2） 温度对发酵的影响（3）最适温度的选择2 pH 对发酵的影响及其控制3 溶解氧对发酵的影响及其控制4 泡沫对发酵的影响及其控制（六）分离、提纯 菌体本身，如酵母菌和细菌等采用过滤、沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来代谢产物采用蒸馏、萃取、离子交换等方法进行提取。27上 上 上 上 上 上 上 上 上产产 品品上 上 上 上上 上 上 上 上 上 上 上上 上 上 上 上上 上