壳聚糖-明胶-透明质酸薄膜的制备及其性能的研究

24卷3期2005年6月中 国 生 物 医 学 工 程 学 报Chinese Journal of Biomedical EngineeringV0124 No3June 2005壳聚糖明胶透明质酸薄膜的制备及其性能的研究刘海峰1 尹玉姬1 毛津淑1 姚康德1 杨光辉2 崔 磊2 曹谊林21(天津大学材料科学与工程学院，天津300072)2(上海组织工程研究与开发中心，上海200235)摘 要：本实验采用表面修饰法和共混法两种不同的方法将透明质酸引入壳聚糖一明胶体系，制备了壳聚糖一明胶透明质酸复合薄膜，考察了薄膜的表面形貌、亲水性和力学性能等理化性能以及生物相容性。实验结果表明，壳聚糖一明胶透明质酸薄膜具有良好的亲水性，而共混法和表面修饰法制备的薄膜在力学性能上各有所长。体外细胞培养结果表明，成纤维细胞在共混法制备的薄膜上的黏附和生长情况要明显好于表面修饰法制备的薄膜。关键词：壳聚糖一明胶体系；透明质酸；表面修饰；共混；成纤维细胞Study on Preparation of Chitosan-Gelatin-Hyaluronic acidmembranes and their propertiesLIU HaiFen91 YIN YuJil MAO JinShul YAO KangDelYANG GuangHui2 CUI Lei2 CAO Yi“n21(Research Institute ofPolymeric Materials，Tianfin University，Tianjin 300072)2(Shanghai Tissue Engineering Research and Develokment Center，Shanghai 200235)Abstract：The chitosan-gelatin-hyaluronic acid membranes were prepared via surface modification and polyblendmethods respectively through COcrosslinking with 1-Ethyl一(3，3-dimethylaminopropyl)carbodiiminde(EDC)and Nhydroxysuccinimide(NHS)in 2-morpholinoethane sulfonic acid(MES)buffer111e results demonstrated thatincorporating hyaluronic acid in chitosangelatin network improved the hydrophilicity and mechanical properties of themembranes obtained7nle comparative study revealed that the human fibroblasts were adhered and proliferated betteron the polyblend membranes than that on the surface modification membranes in vitroKey words：chitosangelatin network；hyaluronic acid；surface modification；polyblend；fibroblasts中图分类号 R31808 文献标识码 A 文章编号02588021(2005)03027106引言透明质酸(HA)是细胞外基质(ECMs)中的糖胺聚糖(GAGs)的组成物。透明质酸在皮肤组织中的保水作用是其最重要的生理功能之一，透明质酸与其他硫酸化粘多糖和胶原蛋白、弹性蛋白等纤维状蛋白质共同组成含大量水分的ECMs，为细胞提供信息。皮肤中的ECMs使皮肤柔韧且富有弹性。HA与硫酸软骨素、硫酸皮肤素等基质成分及其所包含的大量水分，共同形成细胞外空间，有利于营养物质的供应和代谢物的排放，表皮细胞的迁移，免疫细胞(郎格罕斯细胞和淋巴细胞)在表皮中的出入o一。透明质酸分子链上每一个二糖单元带有一个荷负电的羧基(一c00一)，它具有类似离子交换剂的作用，能调节细胞周围阳离子的流动和浓度。透明质酸还可以调控细胞生长因子和细胞因子的分泌，抑制蛋白酶的分解，影响细胞的黏附、生长、迁移、增殖和分化3。-。透明质酸可由天然资源提取或由微生物发酵制备，其羟基可以酯化，且与蛋白质在交联剂的作用下生成网络凝胶，如意大利Fidia先进聚合物公司收稿日期：20021028，修回日期：20040721。基金项目：国家自然科学基金资助项目(59883002，50203007)；国家973资助项目(G199954305)万方数据中 国生物 医学工程学报 24卷采用透明质酸酯制备角质形成细胞转载体系Laserskin，为欧洲共同体批准的第一个组织工程装置，目前已商品化。透明质酸为非抗原性，不会引发炎症和异体排斥反应，其生物降解产物为二糖，对人体无毒副作用-，其缺点是力学性能有限。另一方面，壳聚糖一明胶体系良好的生物相容性已经被证实“J，从而可作为组织工程材料使用。8 o，而将透明质酸引入到壳聚糖明胶体系可缩短细胞在壳聚糖明胶材料表面的适应时间，使细胞尽快进入正常的细胞周期，同时可以有效地抑制材料触发的细胞凋亡阳。因此，将透明质酸引入到壳聚糖明胶体系可更好地模拟细胞外基质的组成，提高仿生程度；同时透明质酸与壳聚糖基材料交联后，可改善复合材料的力学性能。本实验的研究内容就是采用不同的方法将透明质酸引入到壳聚糖明胶体系，考察不同的制备方法对薄膜的表面形貌、亲水性和力学性能等理化性能以及生物相容性的影响。1 实验部分11实验原料壳聚糖(脱乙酰度85，分子量为20万，青岛海汇生物工程有限公司)；明胶(分子量1105，Sigma，USA)；透明质酸(HA)(Sigma，USA)；1一乙基一3，3一二甲基氨基丙基一碳化二亚胺(EDC)(Sigma，USA)；N羟基丁二酰亚胺(NHS)(Sigma，USA)；甲基吗啡磺酸(MES)(上海生工生物工程有限公司)。12实验方法121壳聚糖明胶透明质酸(CSGelHA)薄膜制备方法1(表面修饰法)：取2壳聚糖溶液与4的明胶溶液以体积比为l：4混合，37快速搅拌混合12h，离心脱除气泡，取培养细菌用培养皿(FALCO)，将8ml混合溶液加入培养皿中，置于超净工作台，室温流延成膜。采用EDC对膜材进行化学交联。向装有材料的培养皿中加入20ml含有1透明质酸以及30mM EDC、8mM NHS和50mM MES的溶液，反应2h，室温干燥成膜。方法2(共混法)：制备2的壳聚糖乙酸溶液，4的明胶溶液，1的透明质酸溶液混合，将三种溶液根据质量比为2：7：1，37快速搅拌混合12h，离心脱除气泡，取培养细菌用培养皿(FALCO)，将8ml混合溶液加入培养皿中，置于超净工作台，室温流延成膜。将薄膜浸泡于加入20ml含有50mM的MES的40乙醇的培养皿中30min，弃取液体，加入20nd含有30mM EDC、8mM NHS和50mM MES的溶液中，反应2h，室温干燥成膜。使用前先用紫外线消毒30min，再用70的乙醇溶液浸泡1h灭菌，用无菌的PBS溶液洗涤3次，最后用培养液浸泡30min，反复进行两次。122壳聚糖明胶(CSGel)薄膜制备取2壳聚糖溶液与4的明胶溶液以体积比为1：4混合，37快速搅拌混合12h，离心脱除气泡，取培养细菌用培养皿(FALCO)，将8ml混合溶液加入培养皿中，置于超净工作台，室温流延成膜。采用EDC对膜材进行化学交联。向装有材料的培养皿中加入20fnl含有30ram EDC、8mM NHS和50ramMES的溶液，反应2h，室温干燥成膜。后处理方法同壳聚糖明胶透明质酸薄膜。123壳聚糖明胶透明质酸薄膜形貌将薄膜样品真空条件下喷金后，用HITACHI S520扫描电镜对CsGelHA薄膜的形貌进行观察。124接触角采用接触角测量仪“一82，测定不同制备方法制得的CsGelHA复合膜与蒸馏水之间的接触角，以表征材料薄膜的亲水性。125力学性能薄膜样品均为41cm的直角型样品，用千分尺测量膜的厚度，室温下用万能测试机测定膜材的力学性能。膜材的拉伸速度为10mmmin，检测指标为断裂应力、断裂应变和杨氏模量，实验结果为三个样品的统计平均，以平均值标准偏差表示。126成纤维细胞黏附情况选用第二代成纤维细胞，当细胞培养达到80左右融合状态以后，用10ml无钙镁离子的PBS冲洗两次，经005胰蛋白酶一053 EDTA 37消化5minlOmin，倒置显微镜下见细胞变成透明圆球形，加入10ml胰蛋白酶抑制剂终止消化，用带橡胶头的弯头滴管搔刮、吹打使培养皿中的成纤维细胞呈单个细胞悬液，移入离心管中，1000rprnmin离心5rain，弃去上清，加入DMEM细胞培养液lOml，混匀，台盼蓝染色计数。取处理好的铺有不同薄膜的24孔培养板(FALCO)，将成纤维细胞的单细胞悬液以5103个细胞孔的密度加入孔中，在37，5CO，的培养箱中培养4h后，用滴管小心将培养液吸出，用无菌的PBS溶液洗涤两次以除去处于游离态的细胞。根据Mosman。1刮的方法，对黏附在薄膜表面的成纤维细胞进行MTI“活性测试。127成纤维细胞生长特性 万方数据3期 刘海峰等：壳聚糖一明胶。透明质酸薄膜的制备及其性能的研究将第二代成纤维细胞的单细胞悬液如上所述以5103个细胞孑L的密度，加入处理好的、铺有不同薄膜的24孔培养板(FALCO)中，采用DMEM细胞培养液于37cc，5CO：的培养箱中培养，每隔2d3d更换一次培养液，分别于1d、3d、5d、7d、9d、11d采集样本，用无菌PBS溶液洗涤两次以除去死细胞，然后如前所述，采用Mrr法检测细胞活性，每组选取3个样本取统计平均值。128成纤维细胞生长形貌成纤维细胞在CsGelHA薄膜上生长7d后采集标本，在4。C将标本用2戊二醛溶液中固定2h，使用PBS缓冲溶液洗涤两次，每次10rain。用1的(a)表面修饰法锇酸PBS固定液，固定2h，然后用梯度乙醇逐级脱水，再经HCP一2临界点干燥，BALTEC离子溅射镀金后，用HITACHI S-450扫描电镜观察成纤维细胞在CsGelHA薄膜上的生长形貌并拍照。2 实验结果21壳聚糖明胶透明质酸薄膜形貌采用扫描电镜对不同方法制备的CSGelHA薄膜表面进行观察，发现表面修饰法制备的薄膜的表面比较光滑见图la；而共混法制备的薄膜表面粗糙，具有一定的拓扑结构见图1b。图1 壳聚糖明胶透明质酸薄膜形貌22接触角材料对水的接触角是考察材料表面理化性能的重要指标。而用于组织工程的生物材料，其表面的亲水疏水性能直接影响着细胞在此材料表面的粘lOO80毽60援曩趟40200Cs-Gel HA修饰HA共混不同的膜材料图2制备方法对壳聚糖明胶透明质酸薄膜接触角的影响(。P005，rt=3，与壳聚糖明胶薄膜相比较)(b)共混法附和增殖。不同CsGelHA薄膜的接触角实验结果如图2所示，CsGelHA薄膜的接触角与CsGel薄膜相比显著减小(P005)，说明透明质酸的引入使薄膜的亲水性变得更好。23力学性能根据实验数据的统计分析，与CSGel薄膜的拉伸强度相比较，表面修饰法制备的CSGelHA薄膜的拉伸强度显著提高(P005)；而共混法制备的CSGelHA薄膜的拉伸强度有显著降低(P005)。不同制备方法对CSGelHA薄膜的断裂伸长率的影响是：共混法制备的薄膜的断裂伸长率最高，韧性最好，与其它方法存在显著差异(P005)。24成纤维细胞黏附情况当成纤维细胞接种在不同的薄膜上4h以后，用MTI法检测细胞活性，比较细胞的黏附情况，如图4所示，实验数据为三个样本的统计平均值和标准偏差值。实验数据表明，接种成纤维细胞后，表面修饰法和共混法制备的CsGelHA薄膜上细胞的吸光度万方数据274 中 国生物医学工程学报 24卷值与CsGel薄膜相比有显著差异(P005)。尤其是共混法制备的CsGelHA薄膜，细胞的吸光度要言复越稍是捌10080604020OCsGel HA修饰HA共混(a)不同膜材料的拉伸强度明显高于其他的薄膜。说明细胞在共混法制备的CsGelHA薄膜上最容易黏附并贴壁生长。摹褂出壁碟监(b)不同膜材料的断裂伸长率图3制备方法对壳聚糖-明胶-透明质酸薄膜力学性能的影响(。Po05，n：3，与壳聚糖明胶薄膜相比较)Cs-Gel HA修饰HA共混不同的膜材料图4在不同的膜材料上成纤维细胞的黏附情况(。P005，n=3，与壳聚糖-明胶薄膜相比较)2 O1 81 61 4|12寸l O0806040 2001d 3d 5d 7d 9d 1ld时间(天数)图5成纤维细胞在壳聚椐-明胶-透明质酸薄膜上的生长情况(。P005，n=3，与修饰Cs-Gel-HA薄膜相比较)25成纤维细胞生长特性从图5中可以看到，成纤维细胞在共混法制备的CsGelHA薄膜上的生长增殖情况要明显好于表面修饰法制备的薄膜。从第九天开始，CsGel薄膜和共混CsGelHA薄膜上的成纤维细胞开始显著增长，进入对数生长期，而表面修饰CsGelHA薄膜上成纤维细胞的增长非常缓慢。共混CsGelHA薄膜和表面修饰CsGelHA薄膜上成纤维细胞的吸光度值存在着显著差异(P005)。26成纤维细胞生长形貌成纤维细胞是典型的贴壁生长的细胞，培养时必须贴附在支持物表面才能生长。细胞贴壁生长后形态发生变化，在游离态时，细胞为透明的圆球形；贴壁生长时变为梭形或多角形。当生长达到融合时，成纤维细胞密集排列呈放射状或指纹状旋涡生长。用扫描电镜观察成纤维细胞在不同的CsGelHA薄膜上的生长情况也可以观察到，成纤维细胞在共混薄膜上的铺展形貌要明显好于表面修饰薄膜，细胞相互融合成片，多呈长梭形，细胞间隙狭窄，紧密排列成束，成指纹状结构如图6a；而在表面修饰薄膜上生长的成纤维细胞未能很好舒展，且有些皱缩，有部分细胞呈球形，生长活力也不旺盛如图6b。3 讨论透明质酸与壳聚糖结构类似，也是一种带有吡喃环的刚性分子，由于采用不同的方法将透明质酸固定在壳聚糖明胶体系中，透明质酸与壳聚糖明胶混合的层次就不同。对于表面修饰法，将含有透明质酸和交联剂的溶液注入未交联的呈凝胶态的壳聚糖明胶体系中，透明质酸含有的羧基与壳聚糖的氨基在交联剂作用下，于界面发生反应而固定，同时明胶上的氨基和羧基也可以分别与透明质酸和壳聚糖发生反应，但由于明胶上氨基和羧基含量较低，无法参与壳聚糖与透明质酸之间的竞争，因此，材料表 万方数据3期 刘海峰等：壳聚糖一明胶一透明质酸薄膜的制备及其性能的研究面主要是透明质酸与壳聚糖的交联网络同时混有少量的柔性明胶，且交联集中在界面层，内层是壳聚糖和明胶在渗透进入的交联剂分子作用下形成的交联网络。此时，虽然为固态，但壳聚糖一明胶网络中含(a)共混合有大量水分子，分子链段为水增塑，因此在界面以下相当大的范围里，壳聚糖与透明质酸以及明胶之间可以充分的形成交联网络，而其下方的壳聚糖明胶体系也可以通过壳聚糖的氨基和明胶的羧基交联。(”修饰法图6成纤维细胞在壳聚糖明胶透明质酸薄膜上的生长情况采用共混法制备CsGelHA薄膜，当透明质酸与壳聚糖和明胶溶液混合时，壳聚糖与透明质酸之问由于较强的静电和氨基一羧基间氢键作用，易形成絮状沉淀，它在缓慢滴加和高速搅拌的情况下，可形成均一的白色乳液，溶剂挥发后成膜。透明质酸在壳聚糖一明胶体系中分布的很均匀，但由于薄膜为干燥的固态，大分子链段运动和交联剂渗透困难，所以交联程度较低。表面修饰法和共昆法制备的薄膜的结构示意图如图7所示。表面修饰法 共混法图7不同方法制备的薄膜的结构示意图从SEM电镜照片可以看出，采用共混法，在材料界面，由于透明质酸与壳聚糖的相互作用以及透明质酸的溶胀作用，在溶剂挥发后，形成粗糙的表面结构。而表面修饰法制备的薄膜由于透明质酸仅分布在壳聚糖一明胶体系的上层，所以溶剂挥发后对其表面结构影响不大。透明质酸是链状聚合物，由(1-j34)D葡糖醛酸(113-3)N一乙酰基D一氨基葡糖的双糖单位等摩尔重复连接组成，HA分子中含有的大量的羧基和羟基可与水形成氢键而结合大量的水。电子显微镜下证实透明质酸为线形单链”，在水中扩展成随机的线圈状，直径约为500nm。透明质酸分子中每一双糖单位均含有一个羧基，在生理条件下可解离形成负离子，等空间负离子的相互排斥，使其分子在水溶液中处于松展状，占据大量空间，可结合多于本身1000倍的水。1 2。从接触角的实验结果可以看到，将透明质酸引入壳聚糖明胶体系使材料的亲水性得到了明显的改善。力学实验结果表明，表面修饰法制备的薄膜由于交联效果好，且壳聚糖一透明质酸一明胶交联层较厚，所以在所测样品中其拉伸强度最高。而共混法可能由于存在微观的相分离以及透明质酸的溶胀作用而影响拉伸强度，但是透明质酸在其内部的均匀分布改善了薄膜的亲水性，增加了薄膜的柔韧性，使其断裂伸长率有了明显的提高。研究表明，由于细胞与材料之间存在着一种以蛋白质为介导的黏附机理和黏附特性的差异，故而材料可以影响细胞的黏附、增殖和分化等功能u引。由于细胞真正接触的是材料的表面，因此材料的表面性质对材料的生物相容性有着重要的影响。影响细胞黏附的因素主要有生物学因素和材料因素两个方面1 4|。生物学因素是指同细胞膜的组成和性能有关的细胞膜的荷电性质、细胞的代谢状态、细胞与材料的接触时间、细胞的亲疏水性、细胞的表面电荷、细胞膜分子的运动方向、细胞膜的柔韧性等因素。材料因素主要是指材料表面的亲疏水性、表面自由能、荷电特性、化学结构以及形态结构等因素。万方数据中 国生物医学工程学报 24卷材料表面的电荷性质与电荷密度对细胞的生长有重要的影响，带正电的材料表面与带负电的细胞之间的静电作用有利于细胞的黏附；在材料表面引入氨基、酰胺基、羟基、羧基和磺胺基等基团有利于细胞的黏附和生长；亲水性的材料表面有利于细胞的黏附生长1 5|；粗糙的材料表面不仅有利于细胞的黏附，而且有利于生物膜的迅速再生长u 6|。用表面修饰法和共混法将透明质酸的引入壳聚糖明胶体系，改善了材料表面的亲水性，提高了材料表面的羟基和羧基等基团的含量。但由于制备方法的不同使透明质酸在薄膜上的分布情况不同，从而导致了其在薄膜上的局部浓度差异，此外，共混法薄膜的表面粗糙，具有一定的拓扑结构。所有这些因素使得成纤维细胞在共混法制备的CsGelHA薄膜上的黏附和增殖变得更加容易，细胞可以更快地在材料表面黏附、铺展，缩短细胞在材料上的潜伏期，尽快为蛋白质和其他物质的合成做准备，尽早进入正常的细胞周期。4 结论实验结果表明，用表面修饰法和共混法将透明质酸引入壳聚糖明胶体系，改善了壳聚糖明胶薄膜的亲水性和力学性能，成纤维细胞在透明质酸共混改性薄膜上的黏附和生长增殖情况要明显好于其表面修饰改性薄膜。参考文献Giampaolo Galassi，Paola 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