DB 37T 3113—2018 猪圆环病毒2型抗体胶体金快速检测技术规范

ICS 65.020.30B 41 DB 37山 东 省 地 方 标 准DB 37/T 31132018猪圆环病毒 2 型抗体胶体金快速检测技术规范Antibodies Detection of Porcine Circovirus Type 2 with Colloidal Gold Immunochromatographic Assay2018 - 02 - 02 发布 2018 - 03 - 02 实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局   发 布DB37/T 31132018I前 言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准起草人：李俊、时建立、彭喆、吴晓燕、徐绍建、于江、孙文博、丛晓燕、朱晓琳、韩红、吴家强、杜以军、陈蕾、陈智、刘畅。DB37/T 311320181猪圆环病毒 2 型抗体胶体金快速检测技术规范1 范围本标准规定了猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2，PCV2）的抗体胶体金试纸条制备方法及试纸条使用规范。本标准适用于猪圆环病毒2型的抗体快速检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语与定义下列术语与定义适用于本标准。3.1 PVC板聚氯乙烯板。3.2 BSA牛血清白蛋白。3.3 NC膜硝酸纤维素膜。3.4 PBS磷酸缓冲盐溶液。4 材料及设备4.1 主要仪器设备4.1.1 微量移液器（最大量程分别为 10 L、20 L、100 L、1000 L）。4.1.2 20000 r/min 低温高速离心机。DB37/T 3113201824.1.3 喷膜仪。4.1.4 切条机。4.1.5 PVC 板。4.1.6 0.22m 无菌过滤器。4.1.7 紫外分光光度计。4.1.8 电子天平 精度为：0.001 g。4.2 主要试剂或材料4.2.1 BSA：配制见附录 A.1。4.2.2 氯金酸：配制见附录 A.2。4.2.3 NC 膜。4.2.4 玻璃纤维膜。4.2.5 吸水纸。4.2.6 碳酸钾 分析纯。4.2.7 猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白。4.2.8 羊抗兔 IgG。4.2.9 1PBS 溶液(pH 值 7.4)：配制见附录 A.3。4.2.10 超纯水：符合 GB/T 6682，三级。4.2.11 0.1mol/L Tris-HCL：配制见附录 A.4。4.2.12 Tween-20 分析纯。4.2.13 聚酯纤维膜。5 免疫胶体金试纸条的制备5.1 胶体金的制备所有试剂均需提前经0.22 m无菌滤器滤过。5.1.1 用电炉加热 99 mL 超纯水至沸。5.1.2 加入 1 mL 1 %氯金酸溶液，继续加热 3 min。5.1.3 再缓慢加入 2 mL 1 %柠檬酸钠溶液，边加入边用磁力搅拌器进行搅拌。5.1.4 继续加热，颜色由灰色变为黑色，继而变为亮红色停止加热（约 5 min）。5.1.5 避光室温冷却后，用超纯水补足至 100 mL。5.1.6 用紫外分光光度计分别测其在 520 nm 和 535 nm 处的吸光度值，使其吸光度值在 0.81.0 之间即可。5.2 胶体金标记抗原和标记 pH 值用0.2 mol/L碳酸钾将胶体金溶液调节pH值为8.0后，加入纯化后的猪圆环病毒Cap蛋白，使其终浓度为10 g/mL。5.3 金标抗原的封闭和纯化5.3.1 在金标溶液中加入羊抗兔（IgG），使其终浓度为 1 mg/mL。5.3.2 加入 1/10 体积的 10 % BSA 溶液（终浓度 1%为封闭液）封闭，混匀并静置 15 min。5.3.3 4 ，8000 r/min 离心 20 min 弃上清。DB37/T 3113201835.3.4 用原体积 1/20 且含有 10 %蔗糖的 0.1 mol/L Tris-HCL(pH 值 8.5)储存液重新悬浮沉淀。5.4 玻璃纤维膜、聚酯纤维膜与 NC 膜的预处理5.4.1 聚酯纤维膜（金标结合垫）用 Tween-20，37 浸泡 30 min。5.4.2 玻璃纤维膜（样品垫）、NC 膜用封闭液 37 浸泡 30 min。5.4.3 用 1PBS 溶液(pH 值 7.4) 分别对金标结合垫、样品垫和 NC 膜洗 3 次，37 干燥备用。5.5 喷膜5.5.1 用喷膜仪将标记 Cap 蛋白的胶体金以 5 L/cm 的喷涂量喷涂到金标结合垫上，37 干燥备用。5.5.2 将纯化后的猪圆环病毒 2 型 Cap 蛋白稀释到 1 mg/mL，用喷膜仪按 1 L /cm 的喷涂量喷涂到NC 膜的检测线（T-线）上，37 干燥备用。5.5.3 将羊抗兔（IgG）稀释到 1 mg/mL，用喷膜仪按 1 L /cm 的喷涂量喷涂到 NC 膜的对照线（C-线）上，37 干燥备用。5.6 免疫胶体金试纸条的组装5.6.1 将处理好的样品垫、胶体金结合垫、NC 膜和吸水纸（吸水垫）从上到下粘贴在预先裁好的 PVC胶板上。5.6.2 用切条机裁剪制作试纸条，宽度为 6 mm，组装胶体金检测卡备用。6 免疫胶体金试纸条的检测将检测卡平放在桌面上，将待检血清样品3 滴4 滴（约80 L）加入加样孔（S）内，在室温内静置15 min后，5 min之内判断结果。7 结果和判定7.1 对照线（C）出现一条紫红色线，试验成立。7.2 试验成立条件下，判定结果：a) 检测线（T）处不出现红色线，则待检血清为猪圆环病毒 2 型抗体阴性；b) 检测线（T）处出现一条颜色很浅的紫红色线，则待检血清为猪圆环病毒 2 型抗体弱阳性；c) 检测线（T）出现一条颜色较深的紫红色线，则待检血清为猪圆环病毒 2 型抗体阳性。DB37/T 311320184A A附 录 A（规范性附录）试剂的配制A.1 牛血清白蛋白（BSA）(10 %)牛血清白蛋白    1 g。灭菌超纯水定容至     10 mL。A.2 氯金酸（1 %）氯金酸    1 g。灭菌超纯水定容至  100 mL。A.3 1PBS溶液(pH 7.4)磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27 g。磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42 g。氯化钠(NaCl)：8 g。氯化钾(KCl)：0.2 g。加灭菌超纯水约 8