纳米微粒生物传感器phs

荧 光生物 纳 米 传 感器彭 洪 尚北京交通大学第十二届全国 发 光学 术 会 议2010.11.6于 苏州第十二届全国 发 光学 术 会 议生物传 感器荧 光 纳 米sensoranalytel 生物分子l 电 解 质 离子l 溶解气体l 温度signalprocessing灵敏度高无 损伤响 应 速度快二 维 平面成像生物材料的大小：l 细 胞： 100 -10 uml 细 胞器： 10 -1 um活体 线 粒体中 NADH的多光子成像。 Karl Kasischke, et al. , Cornell University.第十二届全国 发 光学 术 会 议测 量 细 胞中 Ca2+浓 度。 Tsien, R.Y. et al. Science 280, 19541955 (1998).无内源 荧 光有内源 荧 光生物 检测对象直接 测 定 引入 荧 光探 针l 荧 光分子易被 细 胞内某种细 胞器封存，或与胞内成分 发 生非特异 结 合，造成荧 光信号失真l 稳 定性差，存在 荧 光漂白l 单 一的 荧 光波 长 ,受探 针浓 度分布、光 电 子系 统 的随机漂移影响l 为 适 应 自由 进 出 细 胞膜，分子 结 构需特殊的功能化第十二届全国 发 光学 术 会 议荧 光探 针 分子 荧 光 纳 米 颗 粒l 基 质 具有保 护 作用，防止了荧 光分子与 细 胞内成分 发 生作用，同 时 提高了 稳 定性l 提高了 荧 光 强 度（大量 荧 光分子封装于一个 颗 粒中），即高信噪比；同 时 封装两种以上 荧 光分子， 实现 比率 荧光 传 感l 多种成熟 进 入 细 胞方法：基因 枪 、皮量注射 枪 、 细 胞内吞作用第十二届全国 发 光学 术 会 议胞内 检测 温度、 pH的意义l 认识细 胞内的复 杂 的生理 过 程： 细 胞分裂、基因表达、新 陈 代 谢 等l 疾病 诊 断：病 态细 胞温度高于正常 细 胞，酸化的 pH值与 组织 缺 氧以及等其他疾病 态 相关l 肿 瘤治 疗 ：光 热pH值 与 肿 瘤 细 胞耐 药 性有 关系Part I. 荧 光温度 纳 米 传 感器Hydrophilic Fluorescent Nanogel Thermometer for Intracellular Thermometry， C. Gota et al.， J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 2766.第十二届全国 发 光学 术 会 议Temperature-sensitive PolymerWater-sensitive Fluorophore纳 米温度 传 感器的横截面示意 图 。温度探 针 分子 Eu-DT随机分布于 纳米 颗 粒内部（由 BTD-PMMA组 成） ， 纳 米 颗 粒表面覆盖着完整（或 间 断的）二氧化硅薄 层 。第十二届全国 发 光学 术 会 议Luminescent europium(III) nanoparticles for sensing and imaging of temperature in the physiological range. Peng Hongshang et al., Adv. Mater. 2010, 22: 716. 有机硅氧 烷 BTD：碱性 环 境下，硅氧 烷 基 团 迅速水解，以及硅醇缩 聚，在 纳 米 颗 粒表面生成 带负电 二氧化硅薄 层聚甲基丙 烯 酸甲 酯 （ PMMA） ：减少温度探 针 的 掺杂浓 度，从而降低 浓 度猝 灭 以 获 得 较 强 的 发 光和 较长 的 荧 光寿命。 PMMA的折射率 (1.49)与二氧化硅 (1.46)匹配， 这 也使得生成的 纳 米 颗 粒 拥 有较 好的光学透明度。Eu-DT荧 光特性 ：l大的斯托克斯位移 (200-300 nm)l 针 状 发 射峰l 5D0发 射具有 强 的温度依 赖 特性l 可 见 光激 发荧 光温度探 针 分子铕 -三（二 萘 甲 酰 甲 烷 )-二 (三辛基氧化磷 ) （ Eu-DT）第十二届全国 发 光学 术 会 议第十二届全国 发 光学 术 会 议温度 纳 米 传 感器的制 备 及表征再沉淀-封装方法制备纳米颗粒示意图第十二届全国 发 光学 术 会 议Eu-DT掺杂浓 度 对纳 米 颗 粒 荧 光 强 度和寿命的影响根据温度敏感度的定 义 I /(IrefT), 纳 米 颗 粒在生理温度范围 内（ 25-45 oC）的敏感度 为 -3.07%/oC。假 设荧 光 强 度测 量的精确度 为 1%，那么 Eu-DT纳 米 传 感器的温度分辨率可以达到 0.3 oC。荧 光 纳 米 传 感器的温度依 赖 特性之荧 光 强 度25-45oC之 间 ， 荧 光寿命温度敏感度 为 -2.2%/oC。第十二届全国 发 光学 术 会 议荧 光 纳 米 传 感器的温度依 赖 特性之荧 光寿命第十二届全国 发 光学 术 会 议基于 Eu-DT纳 米 颗 粒的生物温敏薄膜的 荧 光成像Eu-DT纳 米 颗 粒置入生物相容性薄膜 聚乙 烯 醇中。不同温度、不同 压 力下的荧 光寿命 伪 彩色成像。 蓝色相 应 于最 长 寿命（ 400 s）， 红 色 对应 于最短寿命（ 122 s）。第十二届全国 发 光学 术 会 议Ratiometric fluorescent nanoparticles for sensing temperature, Peng Hongshang et al., J. Nanopart. Res. 2010, DOI: 10.1007/s11051-010-0046-8.第十二届全国 发 光学 术 会 议比率 荧 光 纳 米 传 感器的 荧 光 强 度的温度依 赖 特性根据温度敏感度的定 义 ， 纳 米 颗 粒的比率 荧 光 强 度在生理温度范 围内（ 25-45 oC）的敏感度 为 -4 %/oCPart II. 比率 荧 光 pH纳 米水凝胶第十二届全国 发 光学 术 会 议第十二届全国 发 光学 术 会 议Honghao Sun， et al., Chem. Mater., 2006, 18 (15), 3381比率 荧 光 pH纳 米 传 感器研究 进 展Preston T. S. et al., J. Am. Chem. Soc., 2006, 128 (41), 13320Hilderbrand S. A. et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19 (8), 1635纳 米水凝胶的截面示意 图 及 组 成成分化学 结 构式。在聚 亚 胺 酯 水凝胶中，溴百里酚 兰 ，香豆素 6和尼 罗红 随机分布。第十二届全国 发 光学 术 会 议Nanogel for Ratiometric Fluorescent Sensing of Physiological pH Values. Hongshang Peng et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49: 4246-4249. l 聚 亚 胺 酯 （ PU）：基 质l 溴百里酚 兰 （ BTB）： pH指示 剂 ， pKa=7.6l 香豆素 6（ C6)： 绿 色 荧 光分子l 尼 罗红 （ NR）： 红 色 荧 光分子第十二届全国 发 光学 术 会 议比率 荧 光 pH纳 米水凝胶的制 备 及表征再沉淀法：将 PU, BTB, C6 和 NR按照一定比例溶于乙醇 /水（ 9/1）的混合溶液中，然后于水中透析 24小 时 ， 经 200nm的膜 过滤 ，即得到水凝胶分散液纳 米水凝胶在水溶液中的粒径分布比率 荧 光 纳 米水凝胶的 pH传 感机理第十二届全国 发 光学 术 会 议比率 荧 光 纳 米水凝胶的 pH响 应 特性第十二届全国 发 光学 术 会 议比率 荧 光 纳 米水凝胶的 pH校正曲 线 。 实验 数据由 620nm 和500nm处 的 荧 光 强 度比 计 算得到， 拟 合方程 为 450 nm激 发 下， 荧 光 纳 米水凝胶在不同 pH值 （ 4.92, 5.29, 5.91, 6.24, 6.47, 6.64, 6.81, 6.98, 7.38, 7.73, 8.04, 8.34, 8.67, and 9.18）下的 荧光 发 射光 谱 BTB的离解平衡式可以表示 为 ：可相 应 得到 BTB 的解离常数 Ka为假定 纳 米水凝胶中 荧 光分子的 荧 光 强 度服从 Beer-Lambert定律：纳 米水凝胶的 荧 光 强 度比率 NR (620 nm) / C6 (500 nm)可以写 为通 过 常数 设 定，最后 简 化 为 下式第十二届全国 发 光学 术 会 议纳 米水凝胶 pH荧 光响 应 性的理 论 推 导在 505 nm和 620 nm处 的 荧 光强 度 变 化分 别为 +8% 和 -8%， 说 明微量 荧 光分子的泄露。第十二届全国 发 光学 术 会 议比率 荧 光 纳 米水凝胶的 稳 定性CA B负载纳 米水凝胶的小老鼠正常 肾 上皮 细 胞（ pH 7.4）的 荧 光 显 微照片：