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利用峰面积分析混合 DNA 样品 【关键词】阴道混合物，强奸，DNA 【中图分类号】D9192；Q75 【文献标识码】B 【文章编号】10079297(XX)01005103 在法医 DNA 检验过程中，经常会遇到多个体的混合样 本， 如受害人和嫌疑人的混合样品，几个嫌疑人的混合样 品。荧光 标记自动分析 STR 系统，不仅能根据位点等位基因的 个数判断 样品是否为混合样品，而且还能根据等位基因峰面积 (谱带荧光 总强度)确定混合样品中各组分的混合比例，推断混合 样品中各 组分的基因分型_1j。Gill 等建立了利用峰面积分析混 合样品的 方法_2。本文利用该法对一宗案件中的混合样品进行 了分析， 推断混合样品各组分的比例及各组分的基因分型。 材料和方法 XX 年于中山某地发生一宗强奸案，送检材料为事主血 纱， 嫌疑人 1 血纱，嫌疑人 2 血纱，以及在嫌疑人 2 住处 提取的一根 带毛囊的阴毛(上沾有少量分泌液)，分别编为 14 号 样品。按 Chelex 一 100 法 提取 DNA，采用 AmpFI STR Identifiler 复合扩 增试剂盒(美国 ABI 公司)同时扩增 D8Sl179、D21Sll、D7S820、 ( F1P0、193S1358、THO1、D13S317、D16S539、D2S1338、 D19S433、vWA、TPox、D18S51、D5S818、FGA 等 15 个 位点和性 别位点 Amelogenin，扩增产物在 ABI310 遗传分析仪上 进行电泳 分离，Genescan30 软件分析结果，GenoTypern 25 软件进行基 因分型。 结 果 一 、样品分型 样品分型结果见表 1。 表 1 样品分型结果 二、结果分析 结果分析方法参照文献2。 (一)确定是否有混合样品 1根据谱带数目。正常情况下进行常染色体 STR 分型 时， 纯合子应检出一条带，杂合子检出 2 条带，混合样品 会出现谱带 数目增多。4 号样品在 D8Sl179 等 3 个位点检出 4 个等 位基因 (表现为 4 条谱带)，在 D21S11 等 6 个位点检出 3 条谱 带，提示 该样品为混合样品。 2等位基因峰面积的不对称。理论上对于杂合子来说， 两 个等位基因的峰面积应大致相等，比例接近于 1；而混 合样品由 于等位基因的叠加，可能会出现不正常的杂合子现象， 两个等位 基因的峰面积差异会增大。表 2 列出了混合比例为 1：10、1：1、 10：1 时出现 2 个等位基因时峰面积的比例。4 号样品 在 TH01、 D13S317、TPOX、D18S51、Amelogene 等位点均检出 2 条带，类似 杂合子，但 2 条带的峰面积明显不平衡(见表 3)，同样 提示 4 号 样本为混合样本，且为男女混合。 (二)确定混合样品中供体的数目 样品 4 所有位点出现的等位基因数最多为 4 个，提示 供体数 为 2 个。 (三)确定混合样品中各供体的基因型组合 对于杂合子来说，两个等位基因的峰面积应大致相等， 比例 接近于 1。基于此原理，分析者可以通过观察到的峰面 积来推断 可能的基因型组合和各组分的比例。对确定是二供体 组成的混 合样本来说，分型结果可以表现为一带型、二带型、 三带型或四 带型。除一带型外，其余各种表现均可提供基因型组 合的信息。 其中四带型由于直观地表现出 2 个供体的基因型， 所以最易于 通过其推断 2 个供体的基因型组合及其比例。 假设某一位点出现的 4 个等位基因依片段由小到大的 顺序 定为 A、B、c、D，观察到的面积分别为 paA、paB、paC、paD，定义 Mx 为所有位点都接近相等，然后给出一个估计的混合 比例 (Mx)，如果解释正确的话，观察值和期望值应接近， 这对任意基 因型组合可用峰面积的剩余值 Eq 来检验，峰面积的剩 余值 Eq= (Pa 观察值一 pa 期望值) ，峰面积的剩余值越低， 该基因型组 合的可能性越高。以 4 号样品的 D8Sl179 位点为例， 混合物中 检出 10(A)、14(B)、15(C)、16(D)，据 Eq 值可推断混 合比例 (Mx)BCAD=062，相反混合比例(Mx)ADBC =038，其他的 基因型组合(如 AB，CD)不可能存在，因为 Eq 不可能接 近零。 表 4 列出了对出现 4 个等位基因的位点的分析，在列 出某个 位点的所有可能的基因型组合后，计算他们各自的 Eq 值，将 Eq 值最小的基因型组合作为推断的基因型组合列入表 4 中。 取表 4 计算出的 Mx 的平均值 036，并定义 Mx 为所有 位点 都接近相等，计算各位点的 Eq 值，见表 4。 可以看出取 Mx 的平均值后，各位点的 Eq 值变化不大 52 分析出现 3 个等位基因比出现 4 个等位基因的模式复 杂的 多，因为排列组合更多，不过可应用同样原则。除部 分位点可推 断基因型并推断各组分比例，大部分出现 3 个等位基 因的位点 只能推断各组分的多少而不能计算出具体数值。 法律与医学杂志 XX 年第 ll 卷(第 l 期) 取表 l 计算出的 Mx 的平均值 036，并定义 Mx 为昕有 位点 都接近相等，计算各位点推断基因型组合的 Eq 值，表 5 列出 Eq 为最小值时的基因型组合。 表 2 出现 2 个等位基因时峰面积的比例的分析 表 3 出现 2 个等位基因的位点的分析 表 4 出现 4 个等位基因的位点的分析 表 5 出现 3 个等位基因的位点的分析 律与医学杂志 XX 年第 11 卷(第 1 期) 表 6 混合样品各组分基因型的推断结果 53 从单个 STR 位点等位基因峰面积计算得出的混合物比 例 Mx 通常可应用于所有位点，但当某几个位点可以推断 基因型组 合并推断混合物比例时，取 Mx 的平均值去验证各位点 的 Eq 值 显得更为准确。 组分的比例越悬殊，基因型组合越易鉴别，比例越接 近，可 能的基因型组合越多，越难判断。需注意的是峰面积 值太低( 1 000 个单位)时判型不准确，应通过增加或减少 DNA 样品浓 度、增加电泳上样浓度、增加电泳进样时间等方法来 提高峰面积 及增加相应峰的平衡，使峰面积更好地反映混合样品 中各组分 的 DNA 比例。研究表明，当混合比例为 1：10 和 10：1 时，较少组 分的等位基因峰面积已接近与主要组分等位基因的 “Stutter”峰 面积 ，所以混合比例过分悬殊时，分析应多加注意。 根据上述计算、分析推断得出样品 4 的混合物比例为 036， 基因型组合见表 6，可以看出组分 1 有 8 个 STR 位点与 嫌疑人 1 基因型相同，可达认定。而组分二则有 8 个 STR 位点 与事主基 因型相同。在 vwA 位点中，1818、1417 的基因型 组合 Eq 值经 计算为 0013 9，并非最小，可能由于等位基因扩增 不平衡所致。 讨 论 本文利用峰面积对两组份的简单混合斑进行分析，方 法简 单，贯穿推断过程的是各等位基因的峰面积剩余值要 接近于零， 峰面积的剩余值越低，该基因型组合的可能性越高。 (1)在确定 样本为两组份的简单混合物后，通过出现 4 个等位基 因的位点 的各峰的峰面积推断可能的基因型组合和该组合的混 合比例， 取平均值。(2)利用此混合比例平均值对出现 3 个等位 基因的 位点和性别位点进行分析，推断出可能的基因型组合 和性别组 合。(3)将推断出的各组分基因型与相关样品基因型比 对：(4) 需注意的是扩增时混合物 DNA 的浓度应控制在一个合 适的范 围，使各等位基因扩增尽量平衡，这样结果更准确。 (5)应尽可 能多做几个位点，位点越多，信息量越大，认定的几 率也越大。 (6)分析时尽量进行盲分析，这样可以保证分析的可重 复性和科 学性，可能会有个别位点出现错误，可将该位点去除 或进行修 正。 参考文献 1郑秀芬，纪贵金，刘超，等二组份混合 DNA 样品 STR 图谱解释中国 法医学杂志，XX，15(4)：203207 2Gill P，Sparker