hplc-esi-ms测定米格列奈钙的血药浓度及其药动学研究

HPLC-ESI-MS 测定米格列奈钙的血药浓度及其药动学研究 彭文兴 1 程钢 1 蔡立婧 2 朱荣华 1 （1 中南大学湘雅二医院临床药学研究室 长沙 410011；2 中南大学药学院 长沙 410013） 摘要：目的：建立人血浆中米格列奈钙片 HPLC-MS 测定法，研究米格列奈钙片在健康志愿者 的药物动力学。方法： 以那格列奈 为内标，血浆样品过 Strata-X 固相萃取柱，用 60 的乙腈 洗脱，洗脱液 20 uL 注入 Thermo C18 色谱柱，柱温 40 。流动相组成为乙腈：0.1 甲酸溶液 (60：40，V/V)，流速：1 mL/min，1/4 分流进入色谱柱,质谱 采用电喷雾电离源正源（ESI+），定量 分析采用选择性离子监测（SIR）。 30 名健康志愿者（男女各半）随机分为三组，每 组 10 人，分 别单剂量口服米格列奈钙片 5 mg（低剂量组）、10 mg（中 剂量组）、20 mg（高剂量组），采集给 药前和给药后血样,于-70 冰箱总保存直到测定。结果：米格列奈在 10-6054 ng/mL 内线性关 系良好，R=0.9982, 萃取回收率均大于 88 ，方法回收率 100.95 103.88 ，日内、 日间 RSD 小于 11 。口服三种 剂量所得 MRT、t1/2、Tmax 相近，且与 给药剂量无关。其体内吸 收程度（C max、AUC0-8 ）与给药剂 量有较好的线性关系，单剂量口服米格列奈后血药浓度时间 曲线符合一级吸收代谢动力学。结论：HPLC-MS 方法简单，准确度高，可用于米格列奈钙片 在人体内的药物动力学研究。 单剂量口服米格列奈后血药浓 度时间曲线符合一级吸收代谢动 力学。 关键词：米格列奈钙；HPLC-ESI-MS；药物动力学 ： 通讯作者：彭文兴，男，副教授。主要研究方向：药物动力学与药物相互作用。 2 High-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry determination of mitiglinide in human plasma and its pharmacokinetics Peng Wen-xing 1 ， Cheng Gang1, CaiLi-jing2, Zhu Rong-hua 1 （1 Clinical Pharmaceutical Research Institute, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha Hunan 410011, China ; 2 School of Pharmaceutical Sciences, Central South University, Changsha Hunan 410011, China; 2） ABSTRACT: OBJECTIVE: To establish a high performance liquid chromatographic coupled with electrospray ionization mass spectrometry (HPLC- MS/ESI) method for the determination of Mitiglinide in human plasma; and apply to pharmacokinetic study. METHOD: Nateglinide was used as internal standard. The plasma samples were extracted by Strata-X solid-phase extraction. 60 acetonitrile eluting. The fractions were injected into evaporated Thermo C18 column(250mm4.6mm，5 m), with the column temperature was set at 40 . The mobile phase was composed of acetonitrile and 0.1 % formic acid (60:40, v/v), with flow rate at 1.0mL/min. Split ratio was 14.The compound was ionized in the turbo electrospray ionization (ESI) ion source of the mass spectrometer and was detected in the selected ion recording (SIR) mode. 30 healthy volunteers (15 male and 15 female) were randomly divided into three groups, each group was administrated 5 mg, 10 mg, 20 mg, respectively, the blood samples was colleted before and after administrate mitiglinide and was frozen at 70 until analysis. RESUETS: The calibration curve was linear in the 10-6054ng/mL range for mitiglinide, R=0.9982. The extraction recovery was above 88 %. The methodological recovery ranged between 101.0 and 103.9 . The intra- and inter-day RSD were less than 11 %. There were no significant differences of MRT, t1/2 and Tmax among three dosages within the studied dose range. The absorption of mitiglinide data（C max、AUC 0-8 ） show the linear relationship with the dose. Mean drug plasma concentration versus time curve of mitiglinide after single dose oral administration of mitiglinide coincide with the process of first-order kinetics. CONCLUSION: The method of HPLC-MS is accurate, and simple and suitable for the study of the pharmacokinetics and metabolism of mitiglinide. Mean drug plasma 3 concentration versus time curve of mitiglinide after single dose oral administration of mitiglinide coincide with the process of first-order kinetics. KEYWORDS: mitiglinide; HPLC-ESI-MS; Pharmacokinetic 米格列奈，属苯丙氨酸衍生物。米格列奈钙是米格列奈的水合钙盐形式，主 要用于 II 型糖尿病患者。本品可使胰岛 细胞上的 K+ATP 通道关闭，使细胞 内 Ca2+浓度增加而刺激胰岛素的分泌。 餐前服用米格列奈钙能有效的控制餐后血糖。被称为“餐时血糖调节剂” 。国 内尚未见国人药动学的研究报道，我们研究其药动学，为临床合理用药提供依据。 本课题采用 HPLC-MS 法建立一种简单便捷、准确性好、灵敏度高的方法研究 米格列奈的人体药动学。 1 材料与方法 1.1 仪器 美国 Waters HPLC-MS 系统，Waters ZQ MS 质谱检测器，Masslynx3.5 工作软 件。 漩涡混合仪（上海琪特分析仪器有限公司） ，高速离心机（IEC Centra MP4） ， 超声波清洗器（上海德力西实业集团沪达继电器厂） 1.2 试剂与试药 米格列奈钙对照品（相当于无水物含量为 94.72 %,山东华鲁制药有限公司） ； 那格列奈对照品（内标，含量 99.58 %，中国药品生物制品检定所） ；乙腈、甲 醇、甲酸（色谱纯） 。 1.3 标准溶液的配制 米格列奈钙标准液配制：精密称取米格列奈钙对照品 11.1 mg，置 50 mL 容 量瓶中，用 30 %甲醇溶解并稀释至刻度，制成 210.3 g/L 的米格列奈钙储备液。 4 取储备液 238 L 置于 50 mL 容量瓶中,用流动相定容至刻度,制成 1.0 g/mL 的 米格列奈钙标准液；取储备液 2.38 mL 置于 50 mL 容量瓶中，流动相定容至刻 度,制成 10.0 g/mL 的米格列奈钙标准液；取储备液 24.00 mL 置于 50 mL 容量 瓶中，流动相定容至刻度,制成 100.9 g/L 的米格列奈钙标准液。 那格列奈标准液（内标）配制：精密称取那格列奈对照品 11.4 mg，置 50 mL 容量瓶中，用 30 %甲醇溶解并稀释至刻度，制成 227.0 g/L 的储备液。取 储备液 2.20 mL 置于 50 mL 容量瓶中，流动相定容至刻度，制成 10.0 g/L 的 内标标准液。 1.4 色谱条件 色谱柱：Thermo C18 柱（250 mm4.6 mm，5 m） ，预柱 Phenomenex C18 柱（10 mm4.6 mm，5 m） 。柱温：40 ，流动相组成为乙腈：0.1 %甲酸溶 液(60：40，V/V)，流速：1 mL/min，1/4 分流流入，约 0.25 mL/min 流入 MS 检 测器。 1.5 质谱条件 电喷雾电离源（ESI+） ，毛细管电压 3.00 kV，离子源温度 120 ，去溶剂 氮气（N 2）的温度为 300 ，流速为 500 L/h，锥孔气体氮气流速为 50 L/h。 米格列奈检测离子为 m/z316.60，锥孔电压为 24 v；内标那格列奈检测离子为 m/z318.6，锥孔电压为 20 v。 1.6 血浆样品处理 1.6.1 血样准备 血浆室温解冻后高速离心 10000 rpm5 min，待上 Strata-X 固相萃取柱。 1.6.2 Strata-X 萃取柱预处 理 1.0 mL 乙腈上萃取柱，自然滤过后，重复一遍，再用 1.0 mL 水过萃取柱， 自然滤过后，重复一遍。 5 1.6.3 血样处理 处理过的 Strata-X 萃取柱上准备好的血样 1mL 后，立即加入内标 80 L（10.0 g/mL 那格列奈） ，自然滤过后，用 1.0 mL 纯净水处理三遍（300 rpm5 min） ， 待测成分用 60的乙腈 1.0 mL 洗脱，自然滤过，用 1.5 mL 的 EP 离心管接洗脱液，振摇 30 s，装入进样瓶中，自动进样器每次取 20 L 进 行 HPLC-MS 分析。 1.7 受试者的选择 30 例受试者均为健康的在校大学生（男女各半） ，年龄 2025 岁，体重 5278 kg，身高 166180 cm，无烟酒嗜好，试验前经询问病史、体格检查和 实验室检查未发现异常。受试者无药物过敏史和药物依赖史、无慢性病史、2 周 内未服用任何可能影响本品吸收代谢的药物。受试期间统一清淡饮食，不使 用除试验制剂以外的任何药物，不接受烟、酒及含咖啡的饮料，受试者试验前 签署知情同意书，并经中南大学湘雅二医院伦理委员会审批同意。 1.8 给药方案 30 名健康志愿者随机分为三组，每组十人，男女各半。志愿者禁食 12 h 后， 次日清晨分别口服 5、10、20 mg 米格列奈钙片，统一用温开水 200 mL 送服。 服药后 2h 可自由饮水，服药后 4h 进食。受试者服药前和服药后 5, 10, 15, 20, 30, 45min 和 1, 1.5, 2, 3, 4, 6，8 h 取血 4 mL。血样置于含有肝素的离心 管中，立即离心，分离出血浆，置-70C 冰箱中保存至测定。 2 实验结果 2.1 色谱-质谱行为 依据选定的色谱条件，在各自的离子通道上采集数据，米格列奈和内标的峰 型良好，无明显的内源性干扰物质。其保留时间分别是 5.33 和 6.81 min。两者 对照品的总离子扫描图，米格列奈及内标对照品质谱图。 6 1.02.03.04.05.06.07.08.0Time010% 010%845scan1 2: Scan ES+ TIC9.81e65.31.891.40.450.7 4.564.2.393.792.9 4.98 6.816.496.407.157.54845scan1 1: Scan ES+ TIC1.32e75.341.901.460.67.5 4.54.2.903.25 6.806.36.0 7.40 图1 米格列奈及内标那格列奈总离子扫描图 Figure1. Mass scan spectra of mitiglinide and nateglinide (IS) 160180202024026028030320340 m/z0 10%845scan1 403 (5.28) 2: Scan ES+ 5.6e316 29820511851716 279297245925887938317318394 图2 米格列奈选择离子质谱图 Figure2. Mass spectrum of mitiglinide 160180202024026028030320340 m/z0 10%845scan1 57 (6.835) 2: Scan ES+ 2.3e6318 1653 27920520170183 297 27241245 30128234031932034150 图3 内标那格列奈选择离子质谱图 Figure3. Mass spectrum of nateglinide 7 2.2 专属性考察 空白血浆色谱图，对照品色谱图，对照品加空白基质色谱图含药血浆色谱图 见下图，从图中可以看出内源性物质不干扰测定。 1.02.03.04.05.06.07.08.0Time010% 010%856blank-03 2: SIR of 1Chanel ES+ TIC1.0e5856blank-03 1: SIR of 1Chanel ES+ TIC1.0e54.81.2 .9 图4 空白血浆色谱图 Figure4. Chromatograms of the blank plasma 1.02.03.04.05.06.07.08.0 Time010%0 10%847dz-10 2: SIR of 1Chanel ES+ TIC2.1e56.72847dz-10 1: SIR of 1Chanel ES+ TIC 1.93e55.31 图5 米格列奈对照品及内标色谱图 Figure5. Chromatograms of standard solutions of mitiglinide and IS in drug-free human plasma. 8 1.02.03.04.05.06.07.08.0 Time010%0 10%847jmd-10 2: SIR of1 Chanel ES+ TIC3.0e56.757.34847jmd-10 1: SIR of1 Chanel ES+ TIC 3.04e55.315.05.796.3 图6 空白血浆加标准及内标色谱图 Figure6. Extract of blank plasma spiked with mitiglinide and IS 1.02.03.04.05.06.07.08.0 Time010%0 10%-4 2: SIR of 1Chanel ES+ TIC1.3e56.79-4 1: SIR of 1Chanel ES+ TIC 5.29e55.36 图7 志愿者服药后血浆样品色谱图 Figure7. Chromatograms of mitiglinide and IS in the healthy volunteers plasma 2.3 线性范围和最低定量浓度 取离心管数支，用空白血浆将米格列奈钙标准液稀释成 10.0，30.0，100.0，300.0，1000.0，3027.0，6054.0 ng/mL 的系列浓度样品， 按“血浆样品的处理”项下操作，以米格列奈与内标峰的面积的比值 X 对药物 浓度(Y)作线性回归，得回归方程 Y=0.00259731x-0.0133321 R=0.9982。最低 定量浓度为 10.0 ng/mL，见图 8。结果表明，在测定范围内，线性良好。 9 Compound 2 name: mtglng Method File: 080406Coefficient of Determination: 0.998197 Calibration curve: 0.00259731 * x + -0.0133321Response type: Internal Std ( Ref 1 ), Area * ( IS Conc. / IS Area ) Curve type: Linear, Origin: Include, Weighting: 1/x, Axis trans: None 0.0 2000.0 4000.0 Conc-0.0133 15.6 Response 图8 标准曲线 Figure8. Calibration curve 2.4 回收率及精密度 配制浓度为 25.0 ng/mL、400.0 ng/mL、5045.0 ng/mL 的米格列奈钙血浆样 品标准管，按“血浆样品的处理”项下操作，测定峰面积，按回归方程计算浓 度，分别在同一天内测定 5 次和每天 5 次连续测定 3 天，考察方法的批内、批 间精密度和回收率。另用流动相配制浓度为 25.0 ng/mL、400.0 ng/mL、5045.0 ng/mL 的米格列奈钙对照品溶液，进样体积与血浆样品标准管相同，测定峰面积， 用于计算萃取回收率。结果得批内 RSD 为 3.4 9.1 (n=5)；批间 RSD 为 8.5 10.2 (n=15)。方法回收率 101.0 103.9 之间，萃取回收率 在 88.15 90.76 之间。见表 1。 表 1 米格列奈的回收率和精密度 Tab1 recovery and precision RSD（%）n=5浓 度 (ng/mL) 萃取回收率 （%）n=5 方法回收率 （%，n=5） 日内 日间 25.0 89.0 103.33.5 3.4 10.2 400.0 88.2 101.04.0 4.0 8.5 5045.0 90.8 103.99.5 9.1 8.6 10 2.5 样本稳定性考察 根据研究的具体情况，进行了米格列奈测定的稳定性研究。方法如下：配制 浓度为25.0 ng/mL、400.0 ng/mL、5045.0 ng/mL的米格列奈钙人血浆样品各 20mL，分装于玻璃离心管中。取上述血样于室温放置，分别于第0、1、2、4、8 h测定其浓度，考察室温放置的稳定性；取上述血样置-70 C冰箱中保存，分别 于0、2、5、10、20 d取出处理待测，考察冰冻贮存的稳定性；取上述血样置- 70 C冰箱及室温中，反复冻融0、1、2、3、4次后测定其浓度，考察反复冻融 的稳定性。按“血浆样品的处理”项下操作，测定峰面积，按回归方程计算浓 度，结果经不同的处置，各浓度的RSD在2.5 %15.0 %之间，证明在这些条件 下米格列奈是稳定的。 2.6 测定方法的质量控制 受试者血浆样品的测定在分析方法确证完成之后进行。在测定的同时建立相 应的标准曲线（即随行标准曲线）及质控样品，质控样品为含药物浓度分别为 25.0 ng/mL、400.0 ng/mL、5045.0 ng/mL 的标准含药血浆样品，血浆样品的浓 度数据用随行标准曲线求得。根据质控样品的测定结果（准确度）评判该批样 品的测定数据是否可被接受或拒绝。 3 药动学研究 3.1 药动学参数 Tmax 、C max 均用实测值；AUC 08 以梯形面积法求得；末端消除速率常数 (z)：用对数药-时曲线末端直线部分的斜率求得； t1/2 = 0.693/z AUC0 = AUC08 + C8/z。 3.2 不良反应 单剂量试验中部分受试者在试验当天出现不良反应现象，表现为出现头晕、 心悸、虚脱感、发冷汗、颤抖等现象，其程度与用药剂量有关，午餐后均好转。 11 其他受试者未见异常。试验完成后，受试者进行第二次体检，体检结果均无异 常。 3.3 药动学结果 表2 米格列奈药动学参数 Table2. Pharmacokinetic parameters after oral administration of mitiglinide 5mg 10mg 20mg Tmax（h） 0.40.2 0.30.2 0.40.2 Cmax (ng/mL) 716.9209.2 1857.8530.2 3551.9929.1 t1/2(h) 1.80.3 1.80.3 1.60.3 AUC08 (ngh/mL) 1071.7337.2 2224.3707.6 5096.71005.6 AUC0-(ngh/mL) 1151.0386.2 2283.7741.7 5210.81006.8 V/F(L) 12.95.8 12.34.0 9.22.8 CL/F(L/h) 4.71.4 4.81.6 4.00.7 MRT08 (h) 2.50.4 2.00.3 2.10.2 从表格中可以看出，单剂量口服 5 mg、10 mg、20 mg 的米格列奈钙片后， 三种剂量口服的达峰时间相近，与文献报道基本一致。米格列奈钙片体内吸收 程度（C max、AUC 0-8、AUC 0- ）有剂量依赖性，但药动学参数个体差异较大；低、 中、高三种剂量的消除半衰期相近，且与给药剂量无关，清除率也相近，体内 平均滞留时间亦相近。 低、中、高三种剂量的消除半衰期相近，且与给药剂量无关；同时米格列奈 钙片体内吸收程度（C max、AUC 0-8）与给药剂量有较好的线性关系，服用不同剂 量米格列奈钙片后 AUC0-8与剂量的相关系数 R2=0.8413。说明单剂量口服米格列 奈后血药浓度时间曲线符合一级吸收代谢动力学。 12 0 1000 2000 3000 4000 5000 0 2 4 6 8 10 T(h) C(n g/m l) 20mg组 10mg组 5mg组 图 9 志愿者单次口服低、中、高三种剂量后平均血药浓度-时间曲线 Figure9. Mean drug plasma concentration versus time curve of mitiglinide after single dose oral administration of mitiglinide y = 259.58x - 352.43 R2 = 0.8413 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 5 10 15 20 25 剂 量 (mg) AUC (ng .h/ ml) 图 10 30名志愿者口服不同剂量米格列奈钙片后 AUC0-8与剂量的相关性 Figure10. AUC0-8 versus dosage correlation of 30 healthy volunteers after single dose oral administration of mitiglinide 4 讨论 4.1 检测器的选择 最初使用 HPLC-UV（Ultraviolet，紫外） 、HPLC-FLD（Fluorescence 13 Detector，荧光检测）进行摸索，结果发现，与文献报道相同，紫外吸收波长 为 210 nm，低于 230 nm，不适合生物样品的测定。使用荧光检测器时，Ex=210 nm，Em=310 nm，F=2.70，故荧光检测器亦不能产生很好的信号。采用 HPLC-MS 的方法，方法简单，准确度好，灵敏度高。在较大浓度范围内线性均很好，最 低定量限较低。 4.2 萃取方法的选择 在实验初，我们考虑使用叔丁基甲醚液-液萃取法，回收率大约只有 50 左右，达不到要求，文献报道采用乙酸乙酯液-液萃取法，由于乙酸乙酯挥发性 不强，N 2 挥干较叔丁基甲醚慢，故考虑用叔丁基甲醚萃取同时加入 1 ml 乙酸乙 酯，后又尝试使用叔丁基甲醚萃取同时加入 1 ml 氯仿进行液-液萃取，萃取率 仍然达不到要求，最后使用固相萃取的方法，回收率达到了 90 以上，同时也 基本消除了内源性物质的干扰。 4.3 对药动学方面的讨论： 该药给药时间是在饭前 5 min，而药物的达峰时间很快，消除半衰期很短， 所以在体内可以很好的降低餐后血糖，控制病情。由于其半衰期很短，只有 20 min 左右，在下一次给药时，前一次的药物已基本消除完全，故不存在体内的蓄 积作用。日本所做的多剂量给药的药动学试验也充分的说明了这一点，所以该药 物的安全性高，能很好的降低餐后血糖。然而在试验过程中，清晨空腹给药后有 些人出现了低血糖、冷汗等不良反应，这与文献上报道不影响正常人血糖不十分 相符，可能是试验空腹造成的影响亦或是个人差异问题。 通过对 30 名受试者用服药后各采血点的血药浓度与时间作图及对其药动学 参数的计算，发现，该药物的个体化差异较大，可能与遗传、生理等因素有关。 但其体内吸收程度（Cmax、AUC 0-8）与给药剂量有较好的线性关系，这与国外研 究结果相同。 我们所得的 t1/2 为 1.272.12 h，而日本健康成年男性的药动学研究其 t1/2 为 1.051.48 h，故该药可能存在地域种族等差异，有待进一步研究。 5 结论 14 本试验建立了 HPLC-MS 测定人血浆样品中的米格列奈钙的方法，样品经固相 萃取后，以内标法进行定量分析，血浆中的内源性物质不干扰待测物的测定。 本方法具有专属、准确、简便可靠等优点，适用于米格列奈钙的人体药代动力 学研究。 药动学参数显示三种剂量口服的达峰时间相近，低、中、高三种剂量的消除 半衰期相近，