snp-cnv分型-qpcr-甲基化

SNP 分型技术 1. 连接酶检测反应(LDR)分型方法 技术原理：主要应用连接酶检测反应 (ligase detection reaction，LDR)技术。 即在 Taq DNA 连接酶的作用下，当左右两条寡核苷酸探针与目的 DNA 序列完全互补，并且 两条探针之间没有空隙时才能发生连接反应，否则连接反应不能进行，最后通过荧光扫描 片段长度，实现对 SNP 位点的检测。 2. 多重 SNaPshot SNP 分型方法 技术原理：SNaPshot SNP 分型是一种以单碱基延伸原理为基础，同时利用多重 PCR 对多个已知 SNP 位点进行遗传分型的方法。在一个含有测序酶，四种荧光标记的 ddNTP， 紧挨多态位点 5端的不同长度延伸引物和 PCR 产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱 基 即终止，经 ABI 3730 测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本 的基因型，根据峰移动的胶位置确定该延伸产物对应的 SNP 位点。 3. MassArray SNP 分型方法 技术原理： Sequenom MassArray 系统主要是利用基质辅助激光解吸电离飞行时 间质谱 (MALDI-TOF MS) 进行分析，即 PCR 扩增产物或者预处理样本在延伸单碱基后，将 制备的样品分析物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，而后用瞬时纳秒 (10-9s) 强激光激发，由于基质分子经辐射吸收能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使 基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子， 这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率 得以分离，在真空小管中飞行到达检测器。 4.直接测序法 技术原理：将待检测片段进行 PCR 扩增并直接测序是 SNP 检测方法中最准确的方法。 纯合位点为单峰，而杂合峰为套峰，因而很容易将几种基因型区分开来。直接测序法不仅 可用于对已知位点的检测，还可用于发现未知的 SNP 位点 5.Taqman 探针方法 技术原理：在 PCR 反应系统中加入 2 种不同荧光标记的探针，它们可分别与 2 个等位 基因完全配对。正常情况下，由于探针 5端荧光基团和 3端淬灭基团紧邻在一起，荧光 被淬灭。随着 PCR 的有效进行，与模板完全配对的探针逐步被 Taq DNA 聚合酶 53 外 切酶活性切割，致使探针 5 端上的荧光基团与 3端的淬灭基团分离，淬灭效应解除，报 告荧光基团被激活；而与模板不能完全配对的探针（代表另一种等位基因）不能被有效切 割，故检测不到荧光信号，通过相应仪器检测荧光值的变化即可实现 SNP 位点检测。 CNV 分型_qPCR 在 PCR 扩增过程中，PCR 产物的量可以用公式 Y= A（1+R） n来表示，其 Y 表示 PCR 产物 的量，A 表示初始模板的量，R 表示 PCR 的扩增效率，n 表示 PCR 的循化数。竞争性 PCR 涉 及到两组模板，一组是待测样本，另一组是人工合成的一段核酸序列，和待测样本目标位 点的序列相比只是在长度上（存在一些碱基的插入或缺失）存在一些差异，用作内对照。 当两组模板处于同一 PCR 反应体系中时，两者具有相同的反应环境和引物结合位点而且扩 增片段的序列组成基本相同，在此情况下两组模板的扩增效率接近一致，因此两种扩增产 物量的比直观的反映了初始模板（待测样本和内对照不存在拷贝数差异）浓度的比，可以 根据内对照的初始模板的量来计算样本的浓度。在检测拷贝数变异时，当待测样本和内对 照有相同的浓度或削除两种模板浓度差异带来的影响时，PCR 产物量的比值直接反映两模 板拷贝数的差异。 造成测序结果中 N 值较多原因 PCR 产物直接进行测序，序列结束后无反应信号。PCR 产物测序一般末端的一个碱基为 A（绿色峰） ，这是由于 Taq 酶能够在 PCR 反应的末端非特异性地加上一个 A 碱基，我们用 T 载体克隆 PCR 产物就是根据该原理的，这样我们很容易辨别 PCR 产物结束的位点。在此序 列 以外就不是我们所要的序列了。 在序列的起始端有时会有一些 N 值。该种情况主要是有未去除的染料单体、样品小片段、 引物二聚体的干扰造成。干扰峰和正常序列峰重叠在一起，仪器无法正确判断出为何碱基。 MAP 公司染料干扰问题基本解决。MAP 公司测序一般 20BP 以后就可精确读取。 在序列的 3端容易产生 N 值。一个测序反应一般可以读出 800-1000bp 的碱基，如果样 品好可以精确读取 800bp，占总反应 80%左右，但是，有 20%只能保证 600bp 以前的碱基是 可靠的，会有许多碱基分不开，就会产生 N 值，这种情况下产生的 N 值是无法避免的。如 果有希望测长我们会调整重测。 测序模板本身含有杂合序列，该种情况主要发生在 PCR 产物直接测序上。由于 PCR 产 物本身是一个混和溶液，相近的片断又很难割胶纯化出来，这样和引物结合就很容易产生 系列杂合序列就会造成在某些位置上有套峰，整个测序信号都非常好，这是由于套峰产生 的 N 值。该种情况明显是客户的样品问题。通过将 PCR 产物克隆后进行测序，可以解决该 种情况的 N 值问题。 造成 N 值，大部分情况是客户样品的问题，如果是测序的问题我们保证免费重新调整测 序一次。 实时荧光定量 PCR 技术的应用 实时荧光定量 PCR 技术是 DNA 定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对 DNA 、 RNA 样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得 到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水 平进行比较。除此之外我们还可以对 PCR 产物或样品进行定性分析：例如 利用熔解曲线 分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及 SNP 检测等。 目前 实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病 研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面： 1. DNA 或 RNA 的绝对定量分析 。包括 病原微生物或病毒含量的检测 , 转基因动植物转 基因拷贝数的检测， RNAi 基因失活率的检测等。 2. 基因表达差异分析。例如比较 经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处 理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结 果的确证 3. 基因分型。例如 SNP 检测，甲基化检测等。 DNA 甲基化分析： DNA 甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、 胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。 原理：DNA 的甲基化是在 DNA 甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使 CpG 二核苷酸 5端的胞嘧 啶转变为 5甲基胞嘧啶。这种 DNA 修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表 达，DNA 甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。 关键词一 CpG 岛： 哺乳动物中，CpG 序列在基因组中出现的频率仅有 1%，远低于基因组中的其它双核苷酸序 列。但在基因组的某些区域中，CpG 序列密度很高，可以达均值的 5 倍以上，成为鸟嘌呤 和胞嘧啶的富集区，形成所谓的 CpG 岛，CpG 岛主要位于基因的启动子（promotor）和第 一外显子区域，约有 60%以上基因的启动子含有 CpG 岛，其 GC 含量大于 50%,长度超过 200bp，在 300-3000 个碱基不等。 在哺乳动物基因组中约有 4 万个 CpG 岛，甲基化一般发 生在 CpG 岛的胞嘧啶处。正常细胞的 CpG 岛由于被保护而处于非甲基化状态。以往的研究 证明启动子区的高甲基化导致抑癌基因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一，而且这种 高甲基化是导致抑癌基因失活的又一个机制。 研究方法： 随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化检测方法被开发出来以满足不同类型研究 的要求。这些方法概括起来可分为三类：基因组整体水平的甲基化检测、基因特异位点甲 基化的检测和新甲基化位点的寻找。针对这三类方法，我们各选出一种常用的方法来介绍， 并提供相应的服务。 方法一 基因组整体水平的甲基化检测甲基化芯片分析： 针对所有的 CpG 岛设计探针序列制作成芯片，如 Agilent、Roche（NimbleGen）的甲基化 芯片，设计 CpG 岛 4 万多个，覆盖人类全基因组所有的 CpG 岛及把有可能做为调控元件的 富含 CG 位点的片 段都包含进来，并通过甲基化片段特异性结合蛋白或抗体，将甲基化位 点片段富集起来，并通过芯片杂交获知 方法二 甲基化特异性的 PCR（Methylation-specific PCR，MSP）用亚硫酸氢盐处理基因组 DNA， 所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；设计两对引物分别 只能与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合处理 方法三 亚