afp的检测(1班3组)

AFP的免疫检测 甲胎蛋白( A F P )主要在胎儿肝中合成,分子量 6 .9 万,在胎儿 1 3 周 A F P占血浆蛋白总量的 13 。在成人 ,AFP可以在大约 80的肝癌患者血清中升高，在生殖细胞肿瘤出现 A FP阳性率为 50。在其他肠胃管肿瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出现 不同程度的升高。但当肝细胞发生癌变时，却又恢复了产生这种蛋 白质的功能而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加，甲胎 蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。过去一直认为 是诊断原发 性肝癌的特异性肿瘤标志物，具有确立诊断、早期诊断、 鉴别诊断的作用。近年大量的临床却发现， AFP达到上千，但多年 都没有肝癌的迹象；同时发现约 20的晚期肝癌患者，直至病故前， AFP仍不超过 10。甲胎蛋白是肝癌的特异性标志，但血清甲胎蛋白 阳性未必都是肝癌。在临床中发现，血清谷丙转氨酶升高的患者同 时有血清甲胎蛋白升高。 一、 AFP单克隆抗体的制备 单抗的理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性 强，可重复性高，对环境的高度敏感性，弱凝集反应和不呈现沉淀 反应，便于人为处理和质量控制并且来源容易。 1、原理：是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种 细胞分别是经抗原免疫能产生抗体的小鼠脾细胞和能在体外长期繁 殖的小鼠骨髓瘤细胞，用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂使细胞融合 产生杂交瘤细胞，通过次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT） 选择基的作用只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经反复的免疫学检 测筛选和单个细胞培养，最终获得既能产生所需单克隆抗体又能长 期体外繁殖的杂交瘤细胞系。将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹 腔，可从小鼠腹水中得到高效价的单克隆抗体。 2、制备步骤 1)获得抗原：市场上购得商品化 AFP,免疫 BALB/c小鼠，获得致敏 的 B淋巴细胞； 2)细胞的选择与融合：建立杂交瘤细胞的目的：是制备对抗原特异 的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原(AFP)免疫的 B 细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是 B细胞聚集的重要场所， 无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。而 另一个细胞则是为了保持融合后的细胞在体外能够长期存活并无限 分裂、繁殖，通常选择小鼠骨髓瘤细胞。 细胞的融合是产生杂交瘤细胞的中心环节，使用细胞融合剂造 成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起，最 佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。 聚乙二醇是目前最常用的细胞融合剂，一般的浓度为 40%左右。 步骤：将骨髓瘤细胞与脾细胞按 1:21:10比例混合，加入 PEG，诱导两种细胞融合，时间控制在 2分钟以内，再加入培养液缓 慢稀释 PEG融合液至失去融合作用，融合细胞形成具有 2个或多个 核的异形体，最终产生杂交细胞。 3）选择培养基 肿瘤细胞合成 DNA通常途径有两条：一为生物合成的主要途径， 可被叶酸拮抗物（氨基蝶呤）阻断；另为替代途径，叶酸代谢受阻 时，细胞通过 HGPRT和 TK，利用核苷酸前体物合成核苷酸，进而合 成 DNA。 HAT培养液筛选后，只有具有两亲本细胞双重特性的杂交瘤细 胞能长期生存并产生抗体，成为制造单克隆抗体的细胞源。 4）阳性杂交瘤细胞的克隆化培养（有限稀释法） 有限稀释法的原理为将细胞悬液连续稀释，最终至 96孔板每个 培养孔内平均含一个细胞，培养 34天后，选择能分泌抗体的单个 细胞群落阳性孔，反复多次克隆，获得由单个细胞增殖形成同源性 的杂交瘤细胞克隆。 方法：经有限稀释后，将细胞培养至覆盖 0%20%孔底时，吸取 培养上清用 ELISA测抗体含量，依 AFP抗体的分泌情况筛选出高抗 体分泌孔，将孔中细胞克隆化，后进行抗原特异的 ELISA测定，选 出高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。 目前采用液氮保存杂交瘤细胞。细胞放入液氮前，需要逐步降 温，如果冻存管放置于-80低温冰箱过夜后再放入液氮中，可长期 保存。复苏细胞时，冻存管取出后，立即 37水浴，使之融化。 5）AFP 单抗获得（动物体内诱生法） 常选用 BALB/c小鼠或与 BALB/c小鼠杂交的 F1代小鼠为接种动 物。接种前一周，在小鼠腹腔内注入降植烷或医用石蜡油 0.5ml。 接种时，每次向小鼠腹腔注射（0.51）106 个杂交瘤细胞。接 种后 1014天，可分次采集腹水，一只可得 1020ml。将收集的腹 水离心去除细胞，灭活（5630 分钟） ，再离心，取上清液，加入 0.1叠氮钠，分装保存于-20。 6）单克隆抗体的纯化（亲和层析法） 亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或 抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。 所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体 （或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白 质分开，达到分离提纯的目的。 方法：取适量腹水离心取上清，用磷酸盐缓冲液（PBS)稀释 4 倍，4过夜，离心取上清，按柱体积 1/10加样，用 0.01mol/L PH7.4的 PBS液洗脱，流速为 1ml/min，再用柠檬酸缓冲液洗脱抗体， 收集洗脱成分。 7） 、单克隆抗体鉴定：包括特异性鉴定、效价测定、纯度鉴定及亲 和力鉴定 二、检测方法 1. 化学发光免疫分析技术 (1)化学发光酶免疫分析（CLEIA） 1)原理：用参与催化某一化学发光反应的辣根过氧化物酶来标记 AFP单克隆抗体，与待测标本中相应的抗原 AFP发生免疫反应后， 形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入 底物鲁米诺，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光 电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再传送至计算机数据 处理系统，计算出测定物的浓度。 2)操作方法： 抗体包被：由聚苯乙烯高分子单体聚合成的微球包被 AFP单抗 加样：标本-洗涤-辣根过氧化物酶标记的单抗-洗涤-加底物鲁米 诺，H 2O2和发光增强剂 显色：辣根过氧化物酶催化鲁米诺显色 3）方法学评价：发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应 体系中发光剂充分，因此发光信号强而稳定，且发光时间较长，检 测方式简单，成本较低。 （2）直接化学发光免疫分析 1）原理：用化学发光剂吖啶脂直接标记 AFP单克隆抗体，与待测标 本中相应的抗原 AFP发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原 -吖啶脂标记抗体复合物，加入氧化剂 H2O2和 pH纠正液 NaOH，成为 碱性环境，吖啶脂即可在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集 光器和光电倍增管接收，记录单位时间内所产生的光子能，这部分 光的积分，与待测抗原量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原 的含量。 2）操作方法： 抗体包被：由聚苯乙烯高分子单体聚合成的微球包被 AFP单抗， 封闭 加样：标本-洗涤-加入吖啶酯标记的 AFP单抗-洗涤-加入氧化剂 （H 2O2）和 PH纠正液（NaOH） 显色：吖啶脂在碱性环境中直接分解发光 3）方法学评价：CLIA 技术是近年来发展起来的新技术，它继承 了同位素灵敏度高的优点，同时克服了其放射性污染及半衰期短的 缺点。由于采用自动化仪器分析，实验条件标准化，人为影响小， 试剂稳定，操作简单无污染。 (3) 电化学发光免疫分析（ECLIA） 1)原理：是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原） ，以三丙胺 （TPA）为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反 应。 2)操作方法： 抗体包被：由磁性微球包被 AFP单抗 加样：标本-洗涤-加入三联吡啶钌标记的 AFP单抗-洗涤-加入电 子供体三丙胺(TPA)缓冲液 显色：三联吡啶钌和 TPA在电场中进行电子转移并发光 3）方法学评价：电化学发光免疫分析法是一种在电极表面由电化学 引发的特异性化学发光反应, 包括电化学和化学发光两个过程, 可 对反应进行精确控制 , 能对各种物质进行快速分析 , 是目前最先进 的标记免疫检测技术，其灵敏度高，准确性好、快捷、简便, 超过 常用放射免疫法和 酶联免疫法 ，可为临床提供理想的检测结果。 但仪器昂贵, 试剂成本也较高, 难以在基层医院开展 。 2酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法 1）原理：先将特异性抗体与固相载体结合，形成固相抗体；加入待 测标本并温育，使标本中的抗原与固相抗体充分反应，形成固相抗 体抗原复合物，洗涤除去其他游离成分；然后加入酶标记抗体并温 育，使固相抗体抗原复合物与辣根过氧化物酶标记抗体结合，形成 固相抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物（双抗体夹心） ，洗涤除去游 离酶标记抗体；加底物，固相载体结合的酶可催化底物成为有色产 物，根据产物的显色程度进行抗原的定性或定量检测。 2）操作方法： 抗体包被：将 AFP单克隆抗体溶于缓冲液（pH9.6 碳酸盐缓冲液） 中，加于由聚苯乙烯制作的 ELISA板孔中，4过夜或 372 小时， 再用 5%-20%的小牛血清封闭。 加样：将包被孔编号，设置空白对照，再在相应的孔上分别加入 阴阳性对照和待测样品，随即加入由改良过碘酸钠法制备的酶标抗 体。轻轻振荡混匀后，置 37温育。 洗涤：在洗板机上选择 5次洗涤程序，洗板后在吸水纸上拍干。 显色：每孔加底物，再加显色剂，充分混匀，室温（1825）避 光反应 5分钟。 终止每孔加硫酸终止液终止反应，阳性者从蓝色变为黄色。 结果判断：酶标仪检测：选择波长 450nm，用空白孔校零，在终 止反应后的 10分钟内测定各孔 OD值。计算：用双对数线性回归或 其他适宜的曲线拟合方式绘制标准曲线，利用该标准曲线计算待测 样品的 AFP含量。 3)方法学评价：酶联免疫吸附法操作简单，适用基层单位使用，但 灵敏度和精密度稍差，线性范围较窄，操作简单, 但其线性范围较 窄 , 而且存在“钩状效应“。 3胶体金免疫技术斑点金免疫层析试验（DICA） 1）原理：是将胶体金标记技术和蛋白质技术相结合的以醋酸纤维素 膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。在膜的一端滴加的标本溶 液受载体膜的毛细管作用向另一端移动，如同层析一般，在移动过 程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体结合而被固相化， 无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判读 实验结果。 2）操作方法：在进行任何测试前必须先完整阅读使用说明书，使用 前将试剂和样品恢复至室温。取出检测试纸条后应在 1小时内尽快 使用。将试剂条按箭头方向插入血清标本中，至少 10秒钟后取出平 放于干净平整的台面上；亦可以不取出，一直放在标本中直到读结 果。注意：血清液面不能超过试剂条的标记线。等待红色条带的出 现，测试结果应在 1030 分钟读取。 3）结果判断：阴性结果：仅出现一条红色条带，即对照线区出现有 色条带，检测线区无色，为正常。阳性结果：出现两条红色条带， 即对照线和检测线区均出现红色条带，表明 AFP 含量高于 25ng/ml。无效结果：当对照线区未出现有色条带，表明试验失败或 试剂失效，需进行重复检测。 注意：在规定的观察时间内，不论检测线区有色条带的颜色深浅， 即使非常弱的色带也应判为阳性。 4）方法学评价：斑点金免疫层析试验，本法虽然存在灵敏度及准确 度不及 ELISA和化学发光等方法，但本法除层析条装置外，不需任 何仪器设备。且具有操作简便，快捷以及操作人员不需技术培训， 试剂稳定，便于保存等特点，故临床可用于某些疾病的普查。 4.时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）双抗体夹心法 1）原理：固相抗体和 Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形成固相抗体 -待检抗原-Eu 3+标记抗体复合物，在酸性增强液作用下，Eu 3+解离下 来并被增强液中的螯合剂螯合成一个具有高强度荧光的稳定螯合物， 在 340nm激发光下发射 613nm荧光。镧系元素的荧光光谱 Stokes位 移较大，一般为 273nm，很容易利用简单的滤光片把激发光和散射 光分开，同时镧系元素螯合物的荧光寿命较长（10-1000 微秒） ，检 测时可在短寿命本底荧光完全衰变后，再测定镧系元素螯合物的特 异性荧光。因此选择镧系元素 Eu3+作标记物。Stokes 位移：激发光 谱与发射光谱的波长差，越大越好。 2）操作方法： 包被：将 AFP特异性抗体包被于固相载体上 加样：加入待测标本洗涤加入 Eu3+标记的抗体（利用具 有双功能基团的螯合剂，一端与 Eu3+结合，另一端与抗体上的氨基 结合）洗涤加入酸性增强液 结果测定：在 340nm的激发光照射下，游离出的 Eu3+螯合物可发 出 613nm的荧光。经时间分辨荧光检测仪测定并推算出待检抗原 的含量。 3）方法学评价：TRFIA 是 20世纪 80年代迅速发展起来的一种公认 最有发展前途的非放射免疫标记技术, 它采用镧系金属离子作为示 踪物, 利用时间分辨荧光测定法排除了非特异荧光干扰, 真正实现 零本底 、灵敏检测超过 TPFIA法；对 AFP 的检测可以看出,该法对 肝癌、肝硬化、 肝炎患者中 AFP含量检测与 RIA 和 ECLIA 无明 显差异，相关性和精密度等指标都与另两种方法相当。具有灵敏度 高示踪物稳定、标准曲线剂量范围宽、自动化程度高、操作简便。 仪器和试剂较为便宜等, 造合在各类医院中开展, 是一种较理想的 非放射性标记分析方法。 5.速率散射比浊法 1）原理：抗原抗体混合瞬间便发生反应，在抗体过量的前提下，反 应由慢到快，单位时间内形成的复合物不断增多，随后逐渐减慢， 连续动态检测可发现某一时间段抗原抗体反应速率最快，单位时间 内形成的免疫复合物最多，散射光强度变化最大，即速率峰，该峰 值大小与抗原浓度呈正相关。选取速率最大，且与被测物浓度变化 呈线性关系的速率峰值，制作剂量-反应曲线，通过计算机计算可获 得被测物浓度的量。 2）操作方法： 仔细阅读说明书，编制分析参数 将待测标本和抗血清分别加入样本盘和试剂盘，输入命令，选择 检测 AFP，仪器自动取样检测并动态监测抗原抗体反应的速率，计 算机对测量数据进行自动分析处理，即可得知标本中抗原含量。 注：抗原过量检测：在测定过程中，抗原抗体迅速反应，在规定时 间内反应介质中的抗体应与标本中抗原全部结合，无游离抗原存在。 此时再加入已知的相同抗原，该抗原与剩余游离抗体结合形成复合 物，可出现第二个速率峰值信号，由此证明第一次速率峰值信号全 部由待测抗原产生。如没有出现第二高峰，则说明待测标本中抗原 浓度过高，测定结果不准确，提示应将标本进一步稀释重新测定， 以保证检测结果的准确性。 3）方法学评价：速率散射比浊法，是抗原抗体结合反应的动力学检 测法，也是目前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具 有快速，灵敏，准确，精密等优点。并且采用抗原过量检测方法， 保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵，对抗体的质量要 求很高。6.免疫放射分析（IRMA）双抗体夹心法 1）原理：先用固相抗体与抗原结合，再用过量的标记抗体抗原的 另一决定簇结合，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃剩余 标记抗体，测固相上放射性。 2）操作方法：用已知抗体包被于固相载体，用另一种已知抗体标记 放射性核素 125I,制备为标记抗体,与待测抗原反应后形成包被抗体- 待测抗原-标记抗体复合物。用已知浓度抗原的系列标准品进行反应， 可得到一条正向剂量反应曲线，如将待测样品进行同样操作，则可 从剂量反应曲线查得样品中的抗原浓度。 3）方法学评价：放射免疫技术有较高的灵敏度，精密度和准确度， 线性范围宽，但是采用放射性核素作为示