（毕业论文）复方白芍保肝颗粒标志性成分检测方法的研究

长春工业大学本科毕业论文 摘 要白芍、葛根、五味子、丹参、甘草是常见的中草药，盛产于中国，对于化学性肝损伤有一定的功效作用。白芍的功效成分为芍药苷，五味子的功效成分为五味子醇甲，丹参的功效成分为丹参酮A和丹酚酸B，葛根的功效成分为葛根素，甘草的功效成分甘草苷。本论文定性和定量的分析了原药材和成品功效成分的含量及检测方法，研究表明用薄层分析法对原药材和成品进行定性分析，用超声提取对成品进行提取，利用紫外分光光度法对原药材和成品进行定量分析，结果表明原药材符合中华人民共和国药典中规定的含量标准，即原药材合格。经测定成品中每100g含芍药苷800mg，葛根素800mg，五味子醇甲300mg。方法学考察表明紫外分光光度法在测定原药材和成品含量时，方法简便，重现性好，结果准确，稳定性好。关键词：保肝；功效成分；紫外分光光度法；薄层分析法；超声波提取法AbstractWhite peony root, kudzu root, Schisandra, red sage root, licorice is a common Chinese herbs，rich in China, the effectiveness of the role of chemical liver injury. The effectiveness of the composition of the white peony is paeoniflorin, the effectiveness of the composition of the Schisandra is schizandrin, the effectiveness of the composition of the Danshen is Tanshinone A and salvianolic acid B, the effectiveness of the composition of the Pueraria is puerarin, the effectiveness of the composition of the licorice is liquiritin.In this thesis, both qualitative and quantitative analysis of the content of the raw herbs and finished effectiveness of the composition and detection methods. That the qualitative analysis of raw herbs and finished with thin layer chromatography，ultrasonic extraction to extract the finished product, quantitative analysis on raw herbs and finished by UV spectrophotometry. The results show that the original ingredients to meet the content standards set forth in the Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China, that is, the original medicinal qualified. The determination of finished products: per 100g of paeoniflorin in 800mg,per 100g of puerarin in 800mg, per 100g of schizandrin in 300mg. Methodology investigated shows UV spectrophotometry in the determination of the original ingredients and finished content, the method is simple, reproducible, accurate and good stability.Key words: liver protection; functional components; ultraviolet spectrophotometry; thin layer chromatography; ultrasonic extraction目 录摘 要IAbstractII第一章 前 言1第二章 文献综述22.1 白芍简介22.1.1 白芍的形态特征22.1.2 白芍的功效作用22.1.3 白芍的利用现状32.2 葛根简介42.2.1 葛根的形态特征42.2.2 葛根的功效作用42.2.3 葛根的利用现状52.3五味子简介52.3.1 五味子的形态特征52.3.2 五味子的功效作用62.3.3 五味子的利用现状62.4 丹参简介72.4.1 丹参的形态特征72.4.2 丹参的功效作用72.4.3 丹参的利用现状82.5 甘草简介92.5.1 甘草的形态特征92.5.2 甘草的功效作用92.5.3 甘草的利用现状92.6 本文的研究内容102.7 本文的研究意义10第三章 实验部分113.1 实验原料113.2 实验设备与试剂113.2.1 实验设备113.2.2 试剂113.3 原药材的定性分析123.3.1 白芍123.3.2 葛根123.3.3 五味子133.3.4 丹参133.3.5 甘草143.4 原药材的定量分析143.4.1 白芍中芍药苷的定量分析143.4. 2 葛根中葛根素的定量分析143.4.3 五味子中五味子醇甲的定量分析153.5 利用超声波提取法提取成品中的功效成分I3.6 紫外分光光度法测定成品中有效成分含量163.7 定性分析成品中功效成分173.7.1 丹参酮A173.7.2 丹酚酸B173.7.3 甘草苷173.8 方法学考察173.8.1 加标回收率试验173.8.2 稳定性试验183.8.3 精密度试验183.8.4 重现性试验193.8.5 准确度实验19第四章 结果与讨论204.1 原材料标准曲线的绘制204.1.1 白芍有效成分芍药苷标准曲线的绘制204.1.2 葛根有效成分葛根素标准曲线的绘制214.1.3 五味子有效成分五味子醇甲标准曲线的绘制224.2 成品中标志性成分含量224.3 加标回收率测定结果234.3.1 芍药苷加标回收率测定结果234.3.2 葛根素加标回收率测定结果234.3.3 五味子醇甲加标回收率测定结果234.4 标准溶液稳定性244.5 精密度试验测定结果244.5.1 芍药苷精密度测定结果244.5.2 葛根素精密度测定结果244.5.3 五味子醇甲精密度测定结果254.6 重现性试验测定结果254.6.1 芍药苷重现性试验测定结果254.6.2 葛根素重现性试验测定结果254.6.3 五味子醇甲重现性试验测定结果264.7 准确度实验测定结果264.7.1 芍药苷准确度实验测定结果264.7.2 葛根素准确度实验测定结果264.7.3 五味子醇甲准确度实验测定结果27第五章 结论与展望285.1 结论285.2 展望28致谢29参考文献30150第一章 前 言本文研制出来的颗粒主要针对化学性肝损伤，利用白芍、葛根等五味中草药为原材料，利用白砂糖和麦芽糊精质粒为附加剂制成的颗粒冲剂。化学性肝损伤，是由化学性肝毒性物质所造成的肝损伤。这些化学物质包括酒精、环境中的化学毒物及某些药物。 作为人体的重要解毒器官的肝脏，具有肝动脉和肝静脉双重血液供应。化学物质可通过胃肠道门静脉或体循环进入肝脏进行转化，因此肝脏容易受到化学物中的毒性物质损害。大自然和人类工业生产过程中均存在一些对肝脏有毒性的物质，称为“亲肝毒物”，这些毒物在人群中普遍易感，潜伏期短，病变的过程与感染的剂量直接相关，可引起肝脏不同程度的肝细胞坏死、脂肪变形、肝硬化和肝癌。（1）酒精是肝脏的巨大威胁长期或间断性大量饮酒可引起肝损伤。酒精直接毒害肝细胞，影响其结构及功能，引起代谢紊乱，不能利用或无力贮存营养物质。长期过度饮酒导致酒精性肝炎、脂肪肝，直至肝硬化。（2）污浊的环境损伤肝脏 空气污染、生活环境恶化是现代人都要面对的问题。特别是城市，空气流通速度缓慢，各种工业废气、汽车尾气等令空气中充满了各种各样的化学毒物，损伤肝脏和身体健康。而另一个需要特别关注的是封闭的办公环境。长时间呆在这样的环境中，对健康非常不利，因为封闭的空调房中不是自然风，空气污浊，损伤肝脏。（3）熬夜使受损肝脏难以修复工作繁忙，生活不规律，经常熬夜，睡眠不足，这样都会引起肝脏血流相对不足，影响肝脏细胞的营养滋润，抵抗力下降。一些人原来已经受损的肝细胞将难于修复并加剧恶化。本论文是复方白芍保肝颗粒研究的子项目，通过紫外分光光度法对原药材（白芍、葛根、五味子、丹参和甘草）及成品标志性成分进行含量测定。 紫外分光光度法对测定原药材及成品标志性功效成分具有简便、快速、准确、选择性好、分析成本低、操作简便、快速等优点，适用浓度范围广。通过对复方白芍保肝颗粒标志性成分检测方法的研究为制定企业标准、工艺选择、工业生产奠定了坚实的理论基础。第二章 文献综述2.1 白芍简介2.1.1 白芍的形态特征白芍（Paeonia sterniana Fletcherin Journ）为毛茛科植物芍药的干燥根（如图2-1）。其味苦、酸，性微寒，功能平肝止痛，养血调经，敛阴止汗1 ，我国民间用于治疗胸腹胁肋疼痛、泻痢腹痛、自汗、阴虚发热、月经不调、崩漏、带下。近年来白芍的药理研究已取得显著进展2， 现代药理实验表明，芍药苷具有镇静、解痉镇痛、抗炎、免疫调节、抗病毒、抗氧化、免疫调节、抗肝损伤、免疫性肝纤维化、平肝止痛、养血调 图2-1 白芍 经、敛阴止汗、保肝护肝、心血管调节等功效3 。毫白芍是安徽“四大”名贵道地药材之一，临床广泛用之4。 2.1.2 白芍的功效作用（1）对免疫系统作用白芍水煎剂对巨噬细胞功能有明显的促进作用，白芍水煎剂对细胞免疫功能有一定的调节作用。白芍水煎液可拮抗环磷酰胺对外周血T淋巴细胞的抑制作用，使之恢复正常水平，表明白芍可使处于低下状态的细胞免疫功能恢复正常2。（2）对中枢神经的作用白芍具有明显镇静作用，白芍对戊四氮、士的宁诱发的惊厥均有对抗作用5。 以白芍为主的方剂可治疗包括便秘、腹泻、腹胀、阴寒、脾虚等肠道应激性综合症6，白芍还可在动物模型中对胃肠道电运动有明显的抑制作用，并与中药柴胡相反。这就为解释白芍的“以缓急痛”治疗胃肠痉挛性疼痛的药理作用提供了新的实验数据，也为研究白芍在古代“治肝安胃”疗法中的作用机理提供了新的思路和方法7。（3）对心血管系统作用白芍水溶物可明显延长异丙肾上腺素所致心肌缺氧的存活时间，对抗由垂体后叶素引起的大鼠心电图变化,增加小鼠心肌对86Rb的摄取量，从而增加小鼠心肌的营养性血流量8。（4）抗炎作用 TGP已对类风湿性关节炎动物模型即大鼠佐剂性关节炎的治疗作用和机理进行了研究。50mg/kg.d静脉给药11d，TGP对大鼠多发性关节炎有明显的防治作用9。（5）抗应激作用白芍水溶物腹腔注射可明显延长小鼠的常压耐缺氧存活时间10。通过试验观察了赤芍、白芍及卵叶芍药醇提物对小鼠有滋补强壮作用，且都延长小鼠游泳时间和小鼠缺氧存活时间，有一定的强壮作用，但对幼年小鼠体重增加无影响，对小鼠记忆力有一定的促进作用，但其作用机理有待进一步研究11。（6）抗病原微生物作用白芍具有抗菌作用强、抗菌谱广的特点12,13。TGP促干扰素诱生及抗病毒作用的研究表明：具有直接抗病毒作用，TGP250mg/L能使水泡性口炎病毒效价下降2.22个对数值14。综上所述，白芍是一类具有多种生理与药理活性的中药，其中TGP已在临床上试用于治疗类风湿性关节炎、肝炎老年性疾病等，效果较好2。2.1.3 白芍的利用现状目前白芍多用于保健行业中，具有明显的功效作用，现已有白芍保健酒系列，也有治疗作用的药品，如白芍总苷胶囊，芍药苷为白芍的主要有效成分之一15，所以目前对芍药苷的提取工艺也有许多方法，根据生产规模不同，各有利弊。目前芍药苷的提取方法有很多，常用的方法有：HPLC法，用HPLC法测定白芍中芍药苷的灵敏度高，操作简单。但由于白芍中含有一些极性小的物质在样品测定时不易从色谱柱上洗脱，连续进样易造成芍药苷在色谱柱上的保留时间逐渐缩短，影响其分离效果16。乙醇加热回流法，提取时间长，杂质溶出率较高，并且操作量大，极大程度上影响白芍药品的质量；超声提取，超声提取技术是由声学和中药化学相互交叉及渗透发展而来，应用于医药、化学、食品等各个领域，特别在中药有效成分提取中显现出了其强大的生命力17。利用超声波产生的强烈的空化效应、扰动效应以及乳化、扩散、击碎和搅拌等多种作用，增加物质分子运动的频率和速度、溶剂的穿透力，从而加速目标成分进入溶剂17。中药材成分十分复杂，而且杂质多、干扰大，因此对样品制备、成分提取技术要求很高。制备技术落后已经是制约中药发展的“瓶颈”之一17。超声提取技术可以简化操作流程，缩短处理时间，提高分离效率18；微波提取，微波提取技术以其在提取率溶剂用量生产成本产品质量等方面优于传统提取的特点，将其应用于天然产物所含有效成分的提取和浓缩具有很好的效果19；水煎煮法，本法适用于大量生产中，精密度较低，水煎煮法温度较高，提取时间长，并易发霉变质，但操作简单，成本低。索氏提取法，该法提取率较高，浸液杂质少，但是提取时间较长，溶剂用量较大。2.2 葛根简介2.2.1 葛根的形态特征葛根（如图2-2）为豆科葛属植物，其根为常用，生药味甘，辛性平，具有降低血管阻力，改善心脑血液循环，减慢心率，降低心肌耗氧量等药理作用20,21 葛根主要有效成分为：葛根素、大豆甙元、芒柄花素、大豆甙等23，其中以葛根素含量最高24。葛根具有解肌退热、生津、透疹，升阳止泻之功效25。葛根作为历代药食同源的植物之一，含有丰富的异黄酮类成分，不仅具有保护心血管系统的作用，还有降血糖降血脂改善微循环抑制血小板聚集以及增强免疫力等作用26。 图2-2 葛根作为常用中药，具有调节血压、增加冠脉血流量27 、改善脑循环28 、抑制血小板聚集29 、抗氧化自由基等作用。临床应用于冠心病、脑血栓也取得了明显的疗效。葛根富含黄酮类化合物和淀粉，也是营养丰富的功能食品原料，已被国家卫生部列入药食同源的天然植物名单30。其中葛根素为主要的有效成分，作为治疗心脑血管的主要临床用21,25,3133。2.2.2 葛根的功效作用 （1）对心脑血管系统的作用：降低血压、减慢心率、降低心肌耗氧量34，葛根还具有减慢心率的作用。葛根黄酮和葛根素使正常和心肌缺血狗心率明显减慢35 葛根总黄酮和葛根素引起血压降低，心率减慢，总外围阻力减少，左心室压力和右心室压力上升最大速率降低，从而降低了心肌的氧耗量；同时又使冠脉血管扩张，冠脉血流量增加，阻力降低而增加氧的供给，氧的供求平衡得到改善，临床上用于心绞痛有一定效力36；扩张冠状血管，改善正常和缺血心肌的代谢34，对脑循环、周围血管及微循环的影响35。（2）降血糖降血脂作用：口服葛根素能使高血糖小鼠血糖明显下降，即血清胆固醇含量减少，但当选用最低有效剂量的葛根素和小剂量阿斯匹林组成复方后，其降血糖作用明显加强，可维持24 h以上，并且能明显改善小鼠的糖耐量，对抗肾上腺素的升血糖作用也明显，并且认为葛根素可能是葛根治疗糖尿病的最主要成分。（3）抗氧化作用：体内外实验表明，葛根异黄酮明显抑制小鼠肝、肾组织及大白兔血、脑组织的脂质过氧化产物丙二醛的升高，且对提高血、脑组织中超氧化物歧化酶活性有极显著作用37。葛根能通过清除氧自由基和抗脂质过氧化而使酒精所致的血液粘度异常变化恢复正常状态38。（4）抗肿瘤：大豆苷元可抑制HL-60白血细胞的增殖，大豆苷元在质量浓度范围为1020 gL-1内具有明显抑制B16黑色素瘤细胞的增殖。另外，葛根提取物对ESC癌、S180肉瘤及Lewis的肺癌均有一定的抑制作用27。（5）抑制血小板聚集作用：静脉注射葛根素也有抑制作用。葛根素质量浓度为0.253.00g/L在试管内对ADP和5-HT诱导的家兔和正常人的血小板聚集亦有抑制作用。葛根素静注0.5mgkg-1还能抑制5-HT从血小板中释放，这对于治疗心绞痛和心肌梗塞很有意义39。（6）对免疫作用的影响：葛根使巨噬细胞(M4)的异物吞噬功能活化，而使初期感染状态下的异物排除功能增强;同时通过活化的M4对细胞性免疫施以影响39。2.2.3 葛根的利用现状从葛根中分离出的淀粉可制成葛根挂面、葛根果冻、葛根奶等大众食品及保健食品又如葛根保健酒、葛根口服液，还有备受喜爱的葛根饼干、葛根冰淇淋、葛根红肠、葛根饮料等，深受国内外用户欢迎。葛根异黄酮在国内外被广泛应用于各类新药中葛根异黄酮具有抗氧化增强机体免疫力的作用，可作为功能性 化妆品添加剂直接加入到各种基质的抗衰老及祛斑美白化妆品中40。葛根素作为葛根的主要功效成分，常用的方法有；热渗滤回流提取法，此法操作简单，浸膏得率高，成本低，生产周期短，但功效成分含量低；超声波提取法，操作时间短，效率高；HPTLC提取法，本提取法与现有生产技术相比具有操作简便产品纯度和产率高成本低的优点；利用HPTLC测定葛根素的含量操作简便，回收率高，板间误差小，方法可靠41；醇渗漉法，用一定浓度的醇溶液对葛根进行渗漉，渗漉液经浓缩即获得含葛根异黄酮的浸膏，该法生产周期长 溶剂耗量大浸膏收得率低，异黄酮含量高40；微波辅助萃取法，此法操作时间长，繁琐，溶剂用量大，但提取率较高；水提法，此法操作简单，无环境污染，提取率高。是生产实验中常选的提取方法。2.3五味子简介2.3.1 五味子的形态特征五味子（如图2-3），又名山花椒、乌梅子，木兰科北五味子属植物，是我国温带针阔叶混交林区域和暖温带范叶阔叶林区域经历第四纪冰川时期后保留下来的第三纪古老植物种之一42，其果实性温，味酸、甜、苦、辣、咸1，主产陕西等省区，具有敛肺、滋肾、生津、止泄之功效，入药主治肺虚、喘咳、自汗、盗汗、慢性腹泻、神经衰弱、健忘、心悸、 图2-3 五味子 失眠、四肢无力、急慢性肝炎、视力衰退等症43。随着现代分析手段对五味子的深入研究4448，发现五味子中含有多种活性成分，具有不同的疗效49，五味子常被分为北五味子和南五味子，其中北五味子是著名的滋补性中药，又名辽五味子、辽五味、北五味，为北五味子的成熟果实，主产于黑龙江、辽宁、林、河北等地，为传统正品，品质优良50。南五味子中主要含有木脂素类及挥发油成分，南五味子木脂素类主要包括五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲和五味子醇甲等51，南五味子的有效成分具有保肝、镇静催眠、抗氧化和抗衰老、抗疲劳及免疫促进等作用52。2.3.2 五味子的功效作用（1）对肝脏的作用 用五味子醇提取物治疗注射四氯化碳后的小鼠，肝细胞的粗面内质网脱颗粒、线粒体肿胀、嵴断裂等症状均明显减轻53；用五味子醇提物，预先24h给药能显著降低大剂量扑热息痛（400mg/kg）肝中毒所致的小鼠死亡率，并防止肝内谷胱甘肽的耗竭，增强肝微粒体代谢扑热息痛的速度，血中扑热息痛含量下降54。（2）对中枢神经的作用 纽心懿等发现腹腔注射明显延长小鼠戊巴比妥纳及巴比妥纳的睡眠时间，五味子醇提物及五味子醇甲对，抑制小鼠由电刺激或长期单居引起的激怒行为，对大鼠回避性条件反射及二级条件反射有选择性抑制作用，从实验结果看来，五味子醇提物及五味子醇甲对中枢神经系统有安定作用和抗惊厥作用减少小鼠自主活动55。（3）抗氧化作用 黄诒森实验发现从华中五味子分离得到的五味子酮和从五味子中分离得到的五味子乙素、五味子二醇对维生素C-NADPH或Fe2+-由半胱氨酸诱发的大鼠脑、肝、肾微粒体的脂质过氧化有显著的抑制作用，其作用强度为五味子酮五味子乙素五味子二醇，比抗氧化剂维生素E的作用强56，五味子酚对阿霉素半醌自由基信号无显著性影响，但对其产生的OH-有显著抑制作用57。（4）对免疫功能的影响 用五味子粗多糖给小鼠按100，200mg/kg多次灌胃具有抗疲劳作用，能使正常小鼠胸腺和脾脏的重量增加，能明显提高小鼠的耐缺氧能力，并增强小鼠静脉注射胶体碳粒的廓清速率58,59。（5）抗衰老作用 五味子浸出液能延缓小鼠大脑皮质毛细胞基膜增厚，降低毛细血管月增长率，改善大脑皮质内的血液供应，通过小鼠寿命试验，给药组较对照组寿命显著延长60。此外还有抗肿瘤作用、对心血管系统的影响、对呼吸系统的影响等。2.3.3 五味子的利用现状近年来，功能性食品在国际上也已经掀起了热潮，随之也出现一些如五味子酒、五味子功效饮料等关于五味子功能性食品，可见其保健、食用价值正逐步为人们所重视。本论文主要利用五味子的功效成分五味子醇甲，常用的提取方法有：超声提取，利用超声波提取法用甲醇提取五味子的有效成分，提取工艺简单，提取效率高，试剂用量少，操作简便61；超临界CO2流体萃取法，以提取压力、提取温度、CO2流量为因素、确定超临界CO2流体提取木脂素的优选工艺为：提取压25MPa，提取温度35，CO2流量2L/min62；超高压提取法，采用超高压提取法提取五味子总木脂素，用均匀设计法确定的最优提取工艺为：提取压力350Mpa，溶剂为质量浓度为70%的乙醇，固液比为1：9063。此外还有水提法、水提醇沉法等。2.4 丹参简介2.4.1 丹参的形态特征丹参是唇形花科鼠尾草属多年生直立草本植物64。中药丹参具有祛瘀止痛活血通经和清心除烦的功效，是我国使用历史悠久的传统中药之一1。其中丹参酮A 是丹参治疗冠心病的主要成分之一，将其磺化制成丹参酮A磺酸钠注射液后，可增加水溶性并提高药理活性65。古有“一味丹参，功同四物”之说，丹参可用于月经不调、经闭经痛、癥瘕积聚、胸腹刺痛、 图2-4 丹参 热痹疼痛、疮疡肿痛、心烦不眠、肝脾肿大、心绞痛66 等症。丹酚酸B( salvianolic acid B，Sal B)是也是其中的代表成分之一， 因其含量较高1。据报道，SalB具有改善缺血、缺氧所致的心肌细胞损伤67,68、抑制心血管收缩69 、抗动脉粥样硬化70 等多方面的心血管药理活性。由于其疗效显著，有关丹参的研究很多71，且日趋深入。 2.4.2 丹参的功效作用（1）血液循环系统作用 丹参对衰弱心脏有改善心功能的作用，但不增加心肌氧耗量，动物实验和临床观察均表明，丹参可使外周微循环障碍得到明显改善，使微循环血流加速72。（2）调节组织修复与再生 丹参制剂能使实验性心肌梗死狗的坏死心肌清除加快，巨噬细胞活跃，成纤维细胞分化和胶原纤维形成较明显，肉芽形成较成熟72。（3）耐缺氧作用 丹参可预防或对抗垂体后叶素所致家兔心肌急性缺氧性T波高耸和ST段的抬高丹参注射液可改善急性缺氧大鼠的氧分压及血氧饱和度，并预防大鼠因脑缺血出现的缺氧性脑细胞损害及脑水肿72。（4）抗炎作用 丹参能抑制白细胞游走 抑制溶酶体释放抑制中性粒细胞趋化性，降低血中前列腺素F2和前列腺素E1含量，减少炎症渗出72。（5）抗肿瘤作用 丹参具有明显抑制肿瘤细胞生长的作用，可增强抗癌药物的作用效力 这可能与丹参调整肿瘤宿主凝血-纤维-血小板系统的功能紊乱及对宿主免疫系统的正性影响有关，丹参能明显增强巨噬细胞的细胞毒样作用72。（6）呼吸系统作用 丹参注射液可明显抑制肺组织纤维化，减少肺组织的炎性细胞浸润，还可保护肺毛细血管内皮细胞和肺型上皮细胞，增加肺毛细血管血流量72。2.4.3 丹参的利用现状目前对丹参的应用有很多方面，有用于治疗心脏疾病方面的复方丹参滴丸，辅助治疗恶性肿瘤的丹参注射剂，用于治疗新生儿缺氧缺血性脑病的复方丹参注射液，用于治疗慢性乙型肝炎的复方丹参滴丸等。本文主要利用丹参中的丹参酮A和丹酚酸B，现代提取方法有：丹参酮A提取方法：（1）有机溶剂（苯）的提取法 将一定量丹参粉末药品用滤纸包好放进索式提取器中，再将一定量的苯放入圆底烧杯中，在水浴加热的条件下将苯蒸出，通过索式提取器冷凝过后，热的苯溶液从上端流入索式提取器中，浸泡滤纸包，反复操作，直至索式提取器里溶液为无色，而后取出圆底烧瓶，利用旋转蒸发器将溶液中苯蒸出，蒸干后，再用相应溶剂使之完全溶解，将溶液稀释到相应浓度。（2）超临（CO2）流体萃取法 利用超临界流体萃取实验装置，将丹参粉末放入萃取釜中，CO2从高压储罐出来后，经低温冷却变成液态CO2，再经高压泵压缩，使之变成超临界流体而进入萃取器，与丹参粉末接触，固体物料中的溶质即溶解于超临界CO2中，对此CO2进行节流膨胀，压力降到低压，喷入分离器，此时溶质在CO2中的溶解度降低而从CO2 中凝聚析出来，汇集于分离器底部排出，而CO2 则从分离器顶部引出，CO2循环使用，分离器底部收集凝聚析出物料，直至无料排出方可停机。另外还有超声提取、醇提法等。丹酚酸B提取方法：（1） 传统水煎法 富志军等74在复方丹参提取工艺的研究中，考察了药材粒度、加水量、浸泡时间、煎煮时间、煎煮次数对总酚酸含量的影响，采用正交试验设计筛选出最佳提取工艺：将药材粉碎过20目筛，加8倍量水浸泡1.5h，煎煮2次，第1次1.5h，第2次加6倍量水，煎1.0h。（2） 超声波提取法 丹参生药中丹酚酸B的提取以70%甲醇为溶剂提取率最高； 其次为70%乙醇，其提取率为70%甲醇的98. 8%75。（3） 回流提取法 最优工艺为用10倍量50%的乙醇回流提取2次，每次1. 5h，所得的3种指标成分含量较高76。此外还有超临界CO2 萃取、微波提取、浸渍法、渗漉法等提取方法。2.5 甘草简介2.5.1 甘草的形态特征甘草为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fish.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（Gly2yrrhizaglabraL.）的干燥根及根茎，具有补脾益气、清热解毒、止痛、调和诸药之功效，用于脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸气短、咳嗽痰多、脘胀、四肢挛急、疼痛、痈肿疮毒，缓解药物毒性和烈性1。甘草是一种常用的中草药，又名美草、蜜甘、甜根子，多生长在我国西北、华北、东北等许多地区，为多年生草本植物77 甘草苷具有补脾益气、解毒保肝、润肺止咳、调和诸药的功效78 图2-5 甘草甘草苷和异甘草素是甘草黄酮类化合物中重要的活性成分，其含量的高低常作为评价甘草质量的重要指标79。2.5.2 甘草的功效作用甘草具有促肾上腺皮质激素的作用，能减少排尿量及钠的排出，增加钾排出，使血钠上升，血钙降低。也可用于抗炎，解毒，镇咳，抗肿瘤，抗菌，抗溃疡等。近年来药理研究表明，甘草也具有防止病毒性肝炎、癌症和高血脂症等疾病。主要是K-ATP和Na酶的活性直接引起水、能量和盐代谢的变化，这些变化作为一种刺激反馈促进AID，ACTH，AVP等激素的分泌，从而加强盐、糖和水代谢，同时产生抗病毒、抗炎、抗过敏等方面的效果。也有日本学者对甘草次酸、甘草甜素的抗癌活性、抗病毒进行筛选，结果表明甘草甜素对爱滋病病毒具有明显的抑制增殖作用；甘草次酸对骨髓瘤及腹水肝癌也有抑制作用。2.5.3 甘草的利用现状甘草及其提取物添加于酱油、饮料、糖果、烤点心、冰淇淋、大豆蛋白仿肉制品、啤酒等食品中，也可用作香烟中增强风味品质。口香糖和果脯蜜饯使用甘草，能增加回味余香，有杀菌、洁齿、消炎润喉等功能；巧克力糖中加入甘草甜素既能强化可粉的特有香味，还可减少可可粉用量近25%，酱油、腌制品等加入甘草甜素具有掩盖盐味引出鲜味的盐熟效果，在面包、蛋糕、饼干等食品中的应用，有疏松增泡增加甜味和柔软化等效果，生啤酒加入甘草发酵，成品泡沫多芳香持久，香烟内拌入甘草能降低缓解烟毒，吐物清香；从甘草中提取的天然抗氧物质，用作油脂和含油脂食品的抗氧剂，总之，甘草集甜味与保健于一体，是十分有前途的天然保健食品添加剂80。本文利用甘草的功效成分甘草苷，常用的提取方法有：树脂吸附法、超声波辅助提取、热回流法、索氏提取法、冷浸法。2.6 本文的研究内容本文综合以上五味中草药，利用它们的功效成分研制出保肝颗粒，对化学性肝损伤有一定的保健作用。首先，定性分析原药材，检验是否符合国家药典，然后定量分析原药材，只需定量分析白芍、葛根、五味子，采用紫外分光光度法测出原药材标志性成分的含量。其次，定性分析成品，只需定性分析出是否含有丹参酮A、丹酚酸B和甘草苷，然后定量分析成品中白芍、葛根、五味子的含量，检验成品是否合格。2.7 本文的研究意义中药配方颗粒作为中药饮片改革的一种新形式，与传统的水煎剂相比，具有免煎易服、携带方便、剂量准确、调配方便、制作工艺科学等81,82。本文抓住市场的空缺研制出保肝颗粒，给人们的生活健康又上了一个“防盗门”。本文采用紫外分光光度法测定药品的含量，更加肯定了紫外分光光度法在测定中草药方面的显著地位，也为以后中草药含量的测定打下了理论基础。第三章 实验部分3.1 实验原料白芍、葛根、五味子、丹参、甘草 长春北京同仁堂药店（红旗街分店）；D-101型大孔吸附树脂 天津欧瑞生物科技有限公司；G和GF254硅胶板 青岛海洋化工厂分厂。3.2 实验设备与试剂3.2.1 实验设备紫外分光光度仪（UV1102） 上海天美科学仪器公司；DHG-9143B5-型电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；DK-8D型电热恒温水槽 上海医用恒温设备厂；JY3002型电子天平（0.01） 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；电子天平（0.0001g） 梅特勒-托利多仪器有限公司；全波长紫外检测仪 上海天美科学仪器公司；索氏提取器 中西远大有限公司；KQ-250DB型数控超声波清洗器 昆山超声波仪器有限公司。3.2.2 试剂芍药苷标品（20mg） 中国药品生物制品检定所；苯甲酸标品（50mg） 中国药品生物制品检定所；葛根素标品（20mg） 飞宇生物科技有限公司；五味子醇甲标品（20mg） 中国药品生物制品检定所；丹参酮A标品（20mg） 飞宇生物科技有限公司；丹酚酸B标品（20mg） 飞宇生物科技有限公司；甘草苷标品（20mg） 中国药品生物制品检定所；浓硫酸（分析纯） 北京化工厂；三氯甲烷（分析纯） 北京化工厂；正丁醇（分析纯） 北京化工厂；95%乙醇(分析纯) 天津富宇精细化工有限公司；石油醚（分析纯） 上海化学试剂公司；甲醇（分析纯） 沈阳市试剂五厂；三氯甲烷（分析纯） 山东海杰化工；香草醛（分析纯） 天津市光复精细化工研究所；甲酸（分析纯） 天津市光复精细化工研究所；乙醚（分析纯） 天津天泰精细化学品有限公司；甲酸乙酯（分析纯） 天津市光复精细化工研究所；乙酸乙酯（分析纯） 北京化工厂；甲苯（分析纯） 天津市福晨化学试剂厂；乙腈（分析纯） 北京化工厂；冰醋酸（分析纯） 天津市福晨化学试剂厂。3.3 原药材的定性分析按照中华人民共和国药典（第一部）2010采用薄层分析法定性分析白芍、葛根、五味子、丹参、甘草。3.3.1 白芍取本品粉末0.5g，加乙醇10ml，振摇5min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液，另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg溶液，作为对照品溶液1。照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10l，分别点于同一硅胶板G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40：5：10：0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应 图3-1的位置上，显相同的蓝紫色斑点1（如图3-1）。3.3.2 葛根取本品粉末0.8g，加甲醇10ml，放置2h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液，另取葛根素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液1。照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10l，分别点于同一硅胶G薄层板上，使成条状，以三氯甲烷-甲醇-水（7：2.5：0.25）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视； 图3-2供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照色谱相应的位置，显相同颜色的荧光条斑1（如图3-2）。 3.3.3 五味子取本品粉末1g，加三氯甲烷20ml，加热回流30min，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1ml是溶解，作为供试品溶液，另取五味子醇甲对照品，加三氯甲烷制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液1。照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各2l，分别点于同一硅胶板GF254薄层板上，以石油醚（3060）-甲酸乙酯-甲酸（15：5：1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯 图3-3 （254nm）下检视；供试品色谱中，在与对照材料色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点1（如图3-3）。3.3.4 丹参（1）丹参酮A取本品粉末1g，加乙醚5ml，振摇，放置1h，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液，另取丹参酮A对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液1。照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（6090）-乙酸乙酯（4：1）为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在于对照药材色谱相 图3-4 应的位置上，显相同颜色的斑点1（如图3-4）。 （2）丹酚酸B取本品粉末0.2g，加75%甲醇25ml，加热回流1h，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液，另取丹酚酸B对照品，加75%甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液1。照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5l，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2：3：4：0.5：2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm） 下检视；供试品色谱中，在于色谱相应的位置上，显相同颜色的 图3-5斑点1（如图3-5）。3.3.5 甘草取本品粉末1g，加乙醚40ml，加热回流1h，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇30ml，加热回流1h，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试品溶液，另取甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液1。 图3-6照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各12l，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15：1：1：2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点1（如图3-6）。3.4 原药材的定量分析采用紫外分光光度法对白芍、葛根、五味子原药材的功效成分进行定量分析。3.4.1 白芍中芍药苷的定量分析（1） 水饱和正丁醇溶液的制备 在150ml分液漏斗中，加入21ml水和100ml正丁醇，振摇3min，静置分层。弃去下层，上层则为水饱和正丁醇溶液83。（2） 白芍总苷的提取 在圆底烧瓶中加入白芍粉末约5g左右，85%乙醇100ml，加热回流2h。过滤，滤液冷却后减压浓缩。将浓缩液用25ml石油醚于分液漏斗中除去脂类，留下水相。水相用水饱和正丁醇溶液萃取，减压浓缩，测含量83。（3） 选用苯甲酸作为标准对照品 原理：因为白芍总苷中的成分芍药苷在紫外230nm处有特征吸收峰，这是由该化合物中的苯甲酰基基团产生的，而苯甲酸也有一样的基团，根据紫外分光光度法的原理，两