agilent1200 高效液相色谱仪工作站学习总结

Agilent1200 高效液相色谱仪工作站学习总结 开首语 本人在 2008年 本人在 2008年 1月 8日至 1月 11日参加 广州 日至 1 11日参加广州 安捷伦科技有限公司的 1200高效液相色 谱仪 安捷伦科技有限公司的 1200高效液相色谱仪 化学工作站的学习 培训，几天学习培训，使 我对 1200液相色谱仪的硬件及软件有了更 全 我对 1200液相色谱仪的硬件及软件有了更全 面的了解和更多的认 识，现在做个总结向大 家介绍如下。 硬件篇 安捷伦高效液相色谱仪 1200由几部分 组成，脱气机，泵 、进样器、柱温箱和检测器。 安捷伦 1200HPLC系统采用积木式堆积 结构，方 便用户按照自己的需要配置不同的的系统，整 个系统的流 路自上而下设计、连接，减小了系 统的死体积和延迟体积。 Agilent 1200HPLC系统堆叠方式 脱气机 安捷伦 1200系列在线脱气机有，微量真空 脱气机 G1379B 、标准真空脱气机 G1322A。原理 基本相同，就是使用半透膜管路，允 许气体分 子通过，液体分子无法通过。A 型用的是微渗 管，B 型用的 是滤膜。流路 A型是左进右出，而 B 型为下进上出，本科室使用的为 A型 G1322A。 使用真空脱气机可以降低噪声，保证保留时间 的重现 性，与 He脱气相比，更方便，更节省费 用。 真空脱气机脱气原理 泵 安捷伦 1200系列泵有： 单元泵：G1310A、 四元泵：G1311A 、 二元泵：G1312A、 二元泵 SL型：G1212B。 单独一个泵腔 泵腔无 法满足溶剂传输系统的要 泵腔 求：连续性、稳定性都不符合标准， 现在新购 仪器中已很少考虑。 单元泵，按溶剂的传输系统有两种，一种是并 联柱塞泵，另一种 是串连柱塞泵。并联柱塞泵 由于两个泵的相位不同，可以补偿流量脉 冲， 但由于单向阀的数量增多，所以容易造成泄漏， 增加了维护使 用的难度。串连柱塞泵左泵腔的 活塞运动速度为右泵腔活塞的 2倍， 因此，相同 时间内，左泵提供的流量为右泵的两倍，左泵 提供的溶 剂一半直接供给系统，另一半被右泵 吸入，稍后供给液相系统，减少 了单向阀的用 量，可以使用压缩因子补偿。 四元泵，其实就是比单元泵多了四元比例阀。 由单元泵可以升级 到四元泵，除了要加上四元 比例阀外，还要更换主板。需要注意的是 ，当 使用盐溶液和有机溶剂时，建议将盐溶液接到 四元比例阀下面 的通道上，有机溶剂接到上面 的通道上。如果经常使用盐溶液，建议 定期用 水冲洗所有的通道以去除阀口上可能出现的盐 沉淀。 四元泵的工作原理 二元泵，有两个泵头，特点是高压混合，无需 脱气；对于有强紫 外吸收的流动相，使用静态 混合器可以降低基线噪声；可以选择溶剂 切换 阀自动进行溶剂切换；对于高盐流动相，可选 择泵头密封垫清 洗装置。所以脱气机不是标准 配置，但增加真空脱气机，流量范围可 以从 0.55ml/min 扩展至 0.055ml/min；加入静态 混合器，使流 动相混合更加均匀；如果配置 溶剂切换阀，则两个泵头可分别控制两种溶剂， 类似四元比例阀 ，但并不完全一样，只能同时 混合两种溶剂，不可实现四种溶剂的同 时使用。 二元泵为高压泵，为后混合式，精度更高， 而且由于为高 压混合，产生的气泡也更少，所 以价格也比四元泵贵得多。四元泵为 低压泵， 流速稳定性相对较差，低压混合容易产生气泡， 在实验中 常会遇到这样的问题，多元 混合中出现流动相不稳定的现象，特别是流动 相配比较低的如小 于 1%，其多元混合效果难以 达到我们的要求，造成保留时间漂移，甚 至得 不到我们预期的色谱峰。明白四元泵的低压混 合的道理，实际 操作中我们发现问题时，有助 于我们对原因的分析。 必要时泵可以 拆御，更换密封垫及滤芯。 对容易出故障部位及处理方法，比如宝石 活塞杆是不能超声的部件，泵头密封垫要成对 更换，实验室中至 少应备有一付 号泵头密封 室中至少应备有一付 4号泵头密封 室中至 少应备有一付 垫，部件号为：5663-6589（用于反相色谱）； 部件号 为： （用于反相色谱）； 0905-1420（用于正相色谱）。同时实验室 应备 （用于正相色谱）。同时实验室应备 ）。 过滤芯， 有 5-10个 PTFE过滤芯，以备日常所需。判断方 个 过滤芯 以备日常所需。 法 为，打开冲洗阀，以水为溶剂， 法为，打开冲洗阀，以水为溶剂，流 速 5ml/min，系统压力大于 10bar就应更换过滤白 ，系统压力大于 就应更换过滤白 头了。 头了。 二元泵的工作原理 进样器，安捷伦 1200系列进样器有： 标准自动进样器 G1329A、 高性能进样器 G1367A、 高性能进样器 SL型 G1367B、 手动进样器 G13 28B。 自动进样器的特殊功能，洗针功能可以把 样品残留降低到最小 限度；多次吸液用于进样 量大于 100l 的情况；程序进样可以非常 灵活 地执行用户的进样程序要求，如多种样品自动 混合，自动进样等 高级功能的自由设置，但是， 由于进样针的扩散，所以进样量越小， 受到扩 散的影响也越大，所以自动混合的准确度还是 难以达到容量 瓶的混合方式。这在做标准由线 时得注意的问题，如为定量则不推荐 小样量的 混合方式。 程序进样方式设置如下图： 第一步：设置进样 第一步： 器 第二步： 第二步：使用进样器程 序（U） 第三步：更多信息（功能项） 第三步：更多信息（功能项） 对于手动进样器，必须了解六通阀的工作原理， 应特别注意的是 进样量少于定量环的 50%或大 于定量环的 3-5倍量是比较准确的，不 过，大家 用自动进样器已经习惯了，如果再用回手动进 样器会不会 有些郁闷？会不会有一种坐惯了宝 马又要回到踩单车的感觉？ 柱温 箱，使用安捷伦柱温箱可以保证柱的稳 定性，从而保证了保留时间的 重现性。恒定的 柱温特别是日温差大的时候更为必要。 检测器，安捷伦 1200系列检测器有，可 变波长检测器 G1314B、 二极管阵列检测器 G1315B、二极管阵列检测器 SL型 G1315C、示 差折 光检测器 G1362A、荧光检测器 G1321A。 本所用的是 VWD的 G1314B型 ，DAD 型及 FLD的就 不多说了。对 VWD型检测器应了解它的工作原 理 ，氘灯的使用维护及更换。需要注意的是， 使用中不要频繁的开关氘 灯，否则影响氘灯 的寿命。 可以利用诊断方式来检测氘灯的能量，当然， 发现氘灯能量降低 时不要马上得出氘灯应该更 换的结论，这也许是流通池脏或有气泡造 成的 能量降低，所以必须用诊断方式检测流通池。 诊断结果大于 0.6 说明流通池很干净，小于 0.2则 说明流通池该清洗了。更换氘灯后要 在诊断日 志中填写更换氘灯，这样氘灯的使用时数便从 零开始。 这里还有一点得注意的是流通池的后压力非常 重要，一定要使用 适当出口连接管，出口管线 要使用专用废液管为系统提供适当的后压 ，不 得私自将废液管截短，以防气泡进入流通池。 但如果压力过高 ，流通池的石英窗片可能破裂。 在这里我要说的是，对安捷伦 1200 高效液 相色谱仪正确的操作方法和定期的维护保养的 是很重要的。 软件篇 软件部分，这就是 1200液相色谱仪的化学 工作站。本所 安捷伦 1200高效液相色谱仪工作 站软件版本为 B.02.01，现在新的版 本为 B.03-01 的了，但这没有太多的差别，新版本增加的只 是一部分 我们很少用到的高级功能。 在这里我就和大家一起讨论一些日常使用 中遇到的细节问题，也 许是我们使用过程中所 容易忽略也容易造成操作问题的。 软件方面 从数据采集，数据分析至报告格 式及打印。 首先我们应该了解，脱 机区别于联机是不 能对仪器进行控制，不能运行诊断。 工作站运行界面：单针进样 工作站运行界面： 工作站运行界面： 工作站运行界面：多针进样 数据采集中主要是分析方法和运行控制， 这是我们操作中常用的 。方法的的概念，方法 是一个参和集，它包括分析一个样品所需要的 所有参数：数据采集参数、数据分析参数及命 令或宏指令等内容。方 法的组成：1、方法信息； 2、仪器/采集参数；3、数据分析参数；4 、运 行时选项表。 我想对方法的编辑大家应该都比较常用和熟悉 的了，在这里我选 一些也许大家不太注意的说 一说吧。编辑方法仪器中，方法编辑选项 里有 四个可选项，1、方法信息（M）；2、仪器/采 集（I）；3、数 据分析（D）；4、运行时选项 表（R）。首先选择所要编辑方法哪一 部分内容。 需要注意的是，不选择某一部分内容，并不意 味着方法 中不含有该部分内容，而仅仅 意味着本次对该部分内容不进行编辑，使用原 方法中设置的参数 。还有，仪器参数设置 四元泵的参数设置。1、停止时间：是仪 器停 止采集数据的时间，并不是泵停止工作的时间。 本例中工作站 仅采集 010 分钟的色谱图，10 分钟后，不再采集数据，但泵仍然继 续工作， 向系统提供流动相。使用自动进样器 时一定要设置适当的停止时间，以保证连续进 样的要求；2、后 运行时间：是指一次运行结束 后，到第二次进样前的等候时间，该时 间用于 系统为第二次进样做好准备。例如：将不感兴 趣的杂质冲洗 出色谱柱，或等待系统中的流动 相真正变成下一次进样的初始比例。 做梯度洗 脱时，一定要设置该数值；3、压力限： 压力的上下限也要合理设置。压力上限不要高 于柱子能够承受的 压力最大值，一般比正常分 析压力高 20bar左右；而压力下限的数值 一般比 正常分析压力低 20bar左右；4、时间表：此处 可以编辑梯度 洗脱程序，规定溶剂比例变化方 式。要注意程序时间与停止时间和后 运行时间 之间的协调关系。单元泵的参数设置界面与四 元泵相比少 了溶剂选择项，参数设置的要求 与四元泵参数设置要求相同，只是此时只有一 种溶剂可供选择， 也无法进行梯度洗脱实验。 二元泵的参数设置要求与四元泵参数设置 要求 相同，只是此时只有 A、B 两种溶剂可供选择。 二元泵 SL的参 数设置可以在溶剂类型处的列表 中选择本次使用的溶剂，并写入对溶 剂描述。 系统将根据你所选择的溶剂自动进行溶剂压缩 因子补偿，保证流 量、比例更加精确。当选择 “使用高级压缩因子校正”选项时，将按 照各 个方法中泵参数部分选择的溶剂的对应的压缩 因子来控制泵， 进而保证流动相的流量和比例 更加精确。 有一个问题，就是在数据 采集完毕洗柱的时候 是不用开灯的，但如果强行关灯则方法运行时 会报错，会提示仪器没有准备就绪。怎么办呢， 在方法的运行时 选项表中有“运行前命令/宏” 和“运行后命令/宏”，我们可不可以 在“运行 前命令/宏”中设置把灯关了呢？当然可以，而 且这是关灯 后再洗柱方法中所必须的，但我在 前面说过，先关灯，仪器会报错， 方法无法运 行。其实很简单，这是因为我们有一个细节 设置关灯后洗柱： 设置关灯后洗柱：第一步 设置关灯后洗柱： 设置关灯后洗柱：第二步 设置关灯后洗柱： 设置关灯后洗柱：第三步 设置关灯后洗柱： 设置关灯后洗柱：第四步 没编好，在方法编辑过程中，进入仪器参数设 置-检测参数 VWD 设置，在右下角选“更多信 息”，点击进入后点选“特殊设置”，对 “当 灯关闭时可进行分析（E）”进行勾选，再在 “运行前命令/宏 ”中输入 LAMP OFF，这样，就 可以实现先关灯后再运行洗柱的方法了 。然后 在“运行后命令/宏”中设置完成后关泵或关闭 闭 工作站， 工作站， 这就是随你所欲啦。关泵为 PUMP OFF，关闭 整个系统为 STANDBY ，这里要说明的是 PUMP OFF和 STANDBY是有区别的，前者为泵的关闭 ， 后者为停泵至待机状态的。如果选 BACK命令， 则关闭工作站。 这是关机方法中的一个小技巧，这当然不 可用在分析方法上，分析方 法中前后宏命令最 好慎用， 特别是在 VWD设置中更不可选特殊设置中勾选 “当关灯时可进行 分析”，不然我们的实验操 作就没有意义了。这是为什么，大家一想 就知 道啦。 还有，在运行时选项表中要注意的问题是，除 非有特殊 要求，一般不建议选择“保存 GLP数 据”、“将方法和数据保存在一 起”选项， GLP 数据是最原始的数据，不允许改动。一般情况 下选择这两种选项只是 浪费硬盘空间而已。 泵的设置方面，特别是梯度洗脱设置中建议先 预览一下，看看是不是我们想要的突变或浙变 效果。 数据分析中重 点在于图谱的处理，以及如何建 立校正表。 有时我们得到的色谱图 并不很理想， 那如何对它进行合理积分以得到比较准确的数 据这是个关键，这 可以从积分事件中进行设置。 斜率灵敏度和峰宽的数值改动要慎重， 因为选 用不同数值，将影响色谱峰起止点的识别，得 到不同的峰面 积，进而影响到所得定量结果的 准确程度。一定要保证处理同一系列 数据（各 个标样数据和未知样品数据）时， 这两个参数值是一致的。最小峰面积和最小峰 高的数值大小不会 影响所得峰面积，仅仅做为 是否对该色谱峰进行积分的标准。积分事 件表 中的积分参数并不是孤立于方法的参数，它们 属于方法的一部 分内容，所以保存积分参数时 应先将积分事件保存到方法中，然后再 保存方 法，积分参数就会被保存下来。如果自动积分 和利用积分事件表设置积分参数都不能满足用 户积分的具体要求 ，那么退出积分事件表，即 可看到上图所示的手动积分工具栏，你可 以使 用手动积分的功能进行积分条件优化，手动积 分不能被直接保 存到方法中，也不建议保存手 动积分参数。 校正，校正即是利用某个峰的峰高或峰面 积来确定其对应组分的 浓度或含量，当检测器 灵敏度针对不同的组分而变化时需要进行校正 ， 检测器对同一组分不同含量响应值发生变化时 需要进行校正。校 正分单级校正和多级校正。 一、单级校正：即单点校正，单点法。仅 有一 个浓度的标样，无论进样几针取平均值， 只要浓度相同，都相当于只做一次校正。单点 校正的两种假设（ 1、响应曲线必须是直线；2、 响应曲线必须通过原点。）都不尽合理 ，使得 单级校正定量结果不准确。但其具有简单、快 速的