两歧双歧杆菌固态培养的研究

两歧双歧杆菌固态培养的研究 摘 要:两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum) ATCC29521 在含质量分数为 20%惰 性固态物质(纤维素)的 MRS固态培养基中,若营养物的质量分数比液体培养基中 营养物的质量分数提高 1倍,则菌体生长量也相应提高 1倍(达 119108cfu/g). 经过 3种固态基质作比较后,发现大豆渣和麦麸为佳,前者的含菌量最高达 514108cfu/g,后者含菌量最高可达 213108cfu/g.通过加入可中和所产酸量的 CaCO3,并用缓冲液代替水配制培养基,结果发现用 pH618的缓冲液配制培养基,培 养后含菌量可达 16108cfu/g,比对照的液体培养提高了 1114倍.通过/液-固先 后培养 0并测定其中活菌数的变化,进一步证明了固态培养的优越性. 关键词:两歧双歧杆菌;固态培养法;益生菌 双歧杆菌是国内外正在快速发展的微生态制剂(益生菌)中的主要菌种.在我国,尽 管目前市场上利 用双歧杆菌制成的活菌制剂品种繁多、剂型多样,但普遍存在着活菌含量低、保 质期短和/亿活菌价 0过高 等缺点1.因此,努力探索该菌的基本生长规律和高密度生长条件,就具有十分重 要的实际和理论意义. 常规的双歧杆菌培养用的几乎都是液体培养法.可是在我们的研究中却发现,用液 体培养基培养后, 不论是静止培养还是搅拌培养,其生长量总是很低.从液体培养的缺点出发,并参 考了双歧杆菌在人体肠 道内固态环境下可以达到高约 1010cfu/g的高密度生长的情况,我们提出了对双 歧杆菌进行固态培养的 设想.在检索了国内外大量文献后,发现目前尚无采用此培养方法的报道.现将初 步研究结果作一报道. 1 材料和方法 菌种:两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum) ATCC29521;培养基:MRS 培养基 2;固态基质:纤维 素(Cellulose SP-100, Serva Co.),麦麸,大豆渣,芋艿渣;厌氧培养装置:825-A 型厌氧罐(沈阳人民医院生 产),亨盖特试管及丁基橡胶塞;仪器:METROHM 654 pH计(made by Metrohm Herisau Switzerland), CDE-280多功能食品搅拌器(顺德市科圣电器实业有限公司). 双歧杆菌的培养法:菌种活化.取少量菌种接入装有 9 mL液体 MRS培养基的亨盖 特试管中,然后 抽气、充氮,重复 3次后,置于 37e厌氧培养 24 h.固态培养.称取固态基质(纤 维素、麦麸、大豆渣等) 放入 10 mL小烧杯中,加 MRS培养液,使固态基质和培养液的总重量为 5 g,并且 不论哪种基质,都使培 养基中营养成分的质量分数为 514%,即 0127 g.灭菌后,接入活化的菌液 1 mL,放 入厌氧罐中经抽气换 气后在 37e下厌氧培养. 双歧杆菌计数用马-周试管计数法4.大豆渣的制作:将新鲜的大豆用水浸泡 24 h,然后用食品搅拌 器搅碎,挤去浆液.芋艿渣的制作:将新鲜的芋艿切成小块,然后用食品搅伴器搅碎,挤 去汁液即成. *收稿日期: 1999-07-01 作者简介:王雪奇(1972),女,硕士研究生;复旦大学微生物及微生物工程系,上海 200433 基金项目:上海市高等学校科学技术发展基金资助项目(95A44)2 结 果 2.1 营养物质量分数的变化对双歧杆菌生长量的影响 在纤维素的质量分数为 20%的固态培养基中,比较了不同质量分数的营养物(MRS 培养基中的营养 成分)对 ATCC29521生长量的影响,结果见图 1.由图 1看出,营养成分的质量分数 相同的培养基中,固态 培养基比液态培养基获得的活菌数多.营养成分的质量分数为 1018%的固态培养 基获得的活菌数最多, 比营养成分的质量分数为 514%的固态培养基活菌数高出 1倍,比营养成分的质量 分数为 1612%的固态 图 1 营养物含量不同的 MRS纤维素培养基对 ATCC29521生长的影响 Fig.1 Number of cfu/g of ATCC29521 in the cellulose solid medium with different concentration of nutrient 培养基高出近 214倍. 2.2 合适固态基质的选择 分别以大豆渣、麦麸、芋艿渣和 纤维素为基质,以液体 MRS培养基 为对照,进行培养.比较的结果见 图 2.从图 2可以看出,麦麸和大豆 渣是较好的基质.以大豆渣为基 质,活菌数达到了 215108cfu/g; 以麦麸为基质,活菌数达到了 211 108cfu/g. 2.3 最适生长 pH值的选择 从文献上得知,双歧杆菌的最 适生长 pH值在 610710之间,pH 在 515以下停止生长5.事实上,在 培养的过程中,由于双歧杆菌产酸, 培养基的 pH值一直在不断地降低. 图 2 ATCC29521在以大豆渣、芋艿渣和麦麸为基质的培 养基中的生长情况 Fig.2 Number of cfu/g of ATCC29521 in the three differ- ent solid media with soybean residue, minced taro and wheat bran 为了解决这一问题,我们在含有纤维素固态基 质的 MRS培养基中加入 01073 g CaCO3以中和所 产的酸,再分别加上 pH值为 515,610和 618柠檬 酸-Na2HPO4 缓冲液6,经 24 h培养后计数.结果 见图 3.由图 3可以看出,pH618 为最适 pH值.加 CaCO3后再加缓冲液起到了较好的培养效果.其 中,培养基中加了 CaCO3和 pH618的缓冲液后,活 菌数达到了 116109cfu/g,这比液体对照高出了 1014倍. 2.4 液-固态先后培养试验 在 5 mL的液体培养基中接入 1 mL菌液,厌氧 培养 24 h后得 6 mL菌液,计活菌数(称前次培养). 将前次培养物在不添加任何新培养液的情况下,分 别按下列条件进行再培养(称后次培养): 1) 6 mL菌液在厌氧情况下再培养 24 h,计活 菌数(称后次培养). 2) 6 mL菌液加入 2 g无营养的纤维素基质中, 进行固态厌氧培养 24 h,计活菌数. 324复旦学报(自然科学版) 第 39卷图 3 ATCC29521生长的最 适 pH值 Fig.3 Number of cfu/g of ATCC29521 in the cellulose solid medium with different pH value A.液体对照;B.加 CaCO3;C.加 CaCO3和 pH512的缓冲液;D.加 CaCO3和 pH610缓冲液;E.加 CaCO3和 pH618缓冲液 3) 6 mL菌液加入 01073 g CaCO3和 2 g无营 养的纤维素基质中,进行固态厌氧培养 24 h,计活菌 数.结果见表 1. 从表 1可以看出,在液体培养基中培养 24 h 后,若仍在同一液体中继续培养 24 h,则活菌数将迅 速降低(与前次培养的活菌数相比降低至 1/10左 右);若将菌液转移到纤维素中进行固态培养,则在 48 h后活菌数几乎不变;若将菌液转移到加有 Ca- CO3作缓冲剂的纤维素中,再经 24 h后活菌数非但 不减少,而且比对照提高了 84倍. 3 讨 论 常规的双歧杆菌培养用的几乎都是液体培养 法.可是在我们的研究中却发现,用液体培养基培 养后,由于双歧杆菌无鞭毛,不能运动,因而菌体大 多沉降在试管底部.这样,试管底部的菌体密集,代 谢产物浓度高,菌体生长较受抑制.这可能就是液 体培养活菌得率较低的原因之一.在我们的实验 中,用液体培养时活菌数在 108cfu/g的数量级上已无法再提高了,而双歧杆菌在 人体肠道内的密度却可 达 1010cfu/g的数量级5.为此,我们模拟了类似肠道内的固态环境,提出了双歧 杆菌固态培养的新方法. 表 1 液-固态先后培养对 ATCC29521生长量的影响 Tab.1 Effect of Liquid-solid cultivation on growth of strain ATCC 29521 措施培养基成分活菌数/ (107cfu#g-1) 活菌数比较(倍数) 与 24 h对照比与 48 h对照比 前次培养(024 h) 5 mL 液体培养基(24 h 对照) 819 110 819 (1)5 mL液体培养基(48 h 对照) 110 0111 110 后次培养(2448 h) (2)5 mL 液体培养基+2 g 纤维素 810 0190 810 (3)5 mL液体培养基+2 g 纤维素+ 01073 g CaCO385 916 85 从结果 1可以看出,在固态培养基中可进行浓醪培养.把培养基中各营养物含量 提高到 2倍后,活菌 数也比 1倍营养物的培养基高出近 1倍.从表 1可以看出,利用/液-固先后培养试 验 0,进一步确证了我们 认为菌体在固态培养基中可更充分地利用营养物、培养空间以达到高密度生长的 设想.甚至,若在固态基 质(纤维素)中加入 CaCO3来中和前 24 h培养所产的酸,可以使菌体继续利用营养 物质,从而导致活菌数 增多.这说明固态培养确能分散或吸附菌体的代谢废物,减少对生长的抑制.从结 果 3可以看出,在固态 培养的条件下,只要控制好适当的 pH值,就能使活菌量比液体培养提高 1014倍. 从结果 2可以看出,以大豆和麦麸为固态基质的培养取得了良好的效果.其原因除 了它们赋予培养 基固态状态外,还可能是为两歧双歧杆菌 ATCC29521提供了若干生长促进物质或 其他营养物. 本研究证实,固态培养较有利于双歧杆菌的高密度生长.它不但具有很大的理论意 义,还有重要的实 践价值.固态培养有突出的优点:它不需要搅拌即可使菌体均匀分布,厌氧要求不 高,大大简化了培养装 置;若把固态基质作为保存活菌的介质,发酵结束后只需稍许加工即可制成胶囊或 添加入食品;若固态基 质本身就是一种较好的营养物,那就更为理想.可见,在微生态制剂开发方面,固态 培养有着广阔的前景. 325第 3期 王雪奇等:两歧双歧杆菌固态培养的研究 参考文献: 1 周德庆,郭杰炎.我国微生态制剂的现状和发展设想.工业微生物J. 1999,29(1): 3443. 2 Collins C H, Lyne P M, Grange J M. Collins Lyne.s microbiological methods (6th Edn)M. London: Butter- worths, 1989. 74. 3 Mortimer P S. The Prokaryotes: A handbook on habitats, isolation and identification of bacteriaM. New York: Springer Verlag Berlin Heidelberg, 1981. 1951-1959. 4 马向前,周德庆.双歧杆菌和乳酸菌的简便快速计数法.微生物学报J. 1997,37(1):6264. 5 Rasic J L, Kurmann J A. Bifidobacteria and their roleM. Birkhauser Verlag: Basel Boston Stutgart, 1983. 166-191. 6 祖若夫,胡宝龙,周德庆.微生物学实验教程M.上海:复旦大学出版社. 1993. A Study of Solid Medium Cultivation for Bifidobacterium bifidum WANG Xue-qi, HUANG Jun, ZHOU De-qing (Department of Microbiology and Microbial Biotechnology, School of Life Sciences) Abstract:If solid MRS medium (containing 20% cellulose) whose nutrient content doubles that of liquid MRS medium is used forBifidobacterium bifidumATCC29521 cultivation, the density of living cells increases to 1.9108cfu/g, which is about twice as much as the density of living cells if liquid medium is used. Three kinds of solid materials were tried as the fillings in the medium and it is concluded that wheat bran and soybean residue were more suitable for the growth. The density of the living cells is 2.3108cfu/g in the wheat bran medium and 5.4108cfu/g in the soybean residue, respectively. CaCO3was used to neutralize the acid produced by theBifidobacteriumce