代谢组学技术及其在动物医学中的应用

代谢组学技术及其在动物医学中的应用 畜牧业作为农业的支柱，畜产品可提高现代人的生活水平，但近年来由于畜产 品(肉、奶、蛋等)出现问题而导致的疾病事件越来越多，人们也越来越重视畜 产品的安全性。动物疾病及兽药毒性等可对畜产品的质量产生影响，需要检测 疾病及兽药对畜产品的影响以保证畜产品的安全。目前，检测疾病及兽药问题 的技术越来越多。代谢组学由于具有易检测、代谢物种类少、技术更通用等优 点，被很多专家认为在畜牧业发展方面具有良好的发展和应用前景。 代谢组学是 20 世纪 90 年代中期由英国学者 Nicholson 等 基于磁共振分析的基 础上提出并发展起来的学科，是研究生物体系在受到内在和外在因素刺激时产 生内源性代谢变化的一门科学。代谢组学在短短几年内取得了迅速发展，每年 发表的相关科学文献和综述的数量都在不断增加，而目前国内应用代谢组学进 行动物医学的研究仍处于初级阶段。 与其他“组学”相比，代谢组学更加直接地表现了生命的代谢过程。研究对象 通常是相对分子质量小于 1 000 Kd 的内源性小分子，反映的是外界刺激或遗传 修饰的细胞或组织的代谢应答变化 1。由于代谢物处于生物系统生化活动调控 的末端，包含着反映生理表型的直接而全面的生物标记物信息，因此，代谢组 学技术日益成为整体性研究生命体系功能变化的非常有力的分析手段口 。 根据研究的对象和目的的不同，Fiehn 等将代谢组学分为 4 个层次，即：代 谢物靶标分析(metabolite target analysis)：对某个或某几个特定组分的分 析； 代谢轮廓(谱)分析(metaboliteprofiling analysis)：对少数所预设的 一些代谢产物的定量分析；代谢组学(metabonomics)：对限定条件下的特定 生物样品中所有代谢组分的定性和定量； 代谢指纹分析 (metabolite fingerprinting analysis)：不分离鉴定具体单一组分，而是 对样品进行快速分类。 1 代谢组学的研究方法 完整的代谢组学一般包括样品的采集、预处理、数据的采集和数据的分析及解 释等流程 。其研究平台主要包括分析技术平台和数据分析平台。实际的研究对 象不同，样品采集及预处理技术也不尽相同。代谢组学力求分析生物体系(如体 液和细胞)中的所有代谢产物，所以整个过程中都强调尽可能地保留和反映总的 代谢产物的全面信息。 11 分析技术平台 核磁共振(NMR)是代谢组学中最早应用也是最常用的技术 I， 目前较常用的有氢谱(HNMR)、碳谱(”CNMR)和磷谱(31pNMR)，其 中以 HNMR 更为广泛 】。应用最广泛、最有效的代谢组学研究技术是气相色 谱一质谱(GCMS) ” “ 和液相色谱一质谱(LCMS)1121 0 前者适宜分析小 分子、热稳定、易挥发、能气化的化合物；而后者能分析更高极性、更高相对 分子质量及热稳定性差的化合物。而且，大多数情况下不需要对非挥发性代谢 物进行化学衍生化处理。 12 数据分析平台通过上述分析技术手段可产生海量的元数据，需要借助于生 物信息学平台对所得的数据进行解释分析。一般常采用无监督的主成分分析 (PCA)1131、非线性映射(NLM)14l、簇类分析(HCA)1151 等和有监督的偏最小 二乘法一判别分析(PLSDA)1161 人工神经元网络(ANN)117分析等数据分析方 法。然而近年来支持向量机(sVM)” -方法已逐渐应用于代谢组学后期数据的判 别分析中， 其预测精度明显优于传统的 PLSDA 方法。 2 代谢组学在动物医学上的应用 21 疾病诊断新陈代谢是生命的基本特征 机体发生病理变化必然会导致代谢产物也发生某种相应的变化。对代谢产物的 变化进行数据采集、分析，寻找疾病的生物标记物，有助于临床对疾病的诊断 与分型” 。对这些由疾病引起的代谢产物的变化进行分析，即代谢组学分析， 能够帮助人们更好地理解病变过程及机体内物质的代谢途径，有助于发现疾病 的生物标记物及辅助诊断疾病。 Mayr 等 叫联合应用蛋白质组学和代谢组学技术研究小鼠动脉平滑肌，通过 两种技术手段将细胞蛋白质变化和其功能改变联系起来，多角度地揭示了动脉 粥样硬化的形成机制。赵剑宇等【 研究关木通染毒后大鼠尿液的代谢表型改变 及其与组织病理和尿液、血浆生化指标的相关性。结果试验综述发现大鼠肾脏 出现不同程度的炎症坏死，尿样中氧化三甲胺、枸橼酸、牛磺酸、肌酐、甜菜 碱等代谢物均有不同程度的下降，而醋酸、丙氨酸则显著上升。PCA 表明，给 药组与对照组的代谢谱有明显差异，可以被区分。而造成组间差异的主要影响 因素是醋酸和氧化三甲胺的变化，这些代谢物的变化说明动物尿液代谢组学分 析能够较好地反映关木通的肾毒性特征。随着现代分析手段和计算机技术的迅 速发展，代谢组学必将在动物疾病诊断领域发挥更大的作用。除在疾病诊断中 发挥作用外，代谢组学技术也已经被用于机体健康状况的评价，特别是营养水 平对健康的影响 。 22 药物的毒性评价 Nicholson 研究小组利用基于 NMR 的代谢组学技术在药物 的毒性评价方面做了大量颇具成效的工作。其工作涵盖分析平台的建立、方法 的重现性、基因改变及相应代谢响应的特性研究、相应化学计量学方法等。 Nicholson 教授等23最早将 NMR 与模式识别技术结合检测代谢表型中的动态 变化，并应用于药物毒理标示物的研究。 Kleno 等 24 嗵过大鼠肝给药，使用HNMR 技术测定给药后 48 h 内内源性代 谢物的变化，得出单剂量的肼引起的变化与糖代 i 身十和脂代谢密切相关的结 论并找出了生物标记物，从而研究了肼毒性与糖代谢和脂代谢的关系。 Elaine Holmes 等 I l 研究了以 NMR 为基础的代谢组学技术在神经毒性研究中 的应用，通过高分辨率的 NMR 技术对血浆、脑脊液和尿液产生的可解释的代谢 指纹分析，发现与病理状态存在潜在的关系。这项技术已成功地应用于神经退 行性疾病的临床研究，如亨廷顿氏病、肌肉萎缩症和小脑性共济失调。这种技 术的扩展，魔角旋转 HNMR 光谱，可用 f 产生代谢信息。Mortishiresmith 等 。研究脂肪酸代谢与毒性关系：给大鼠服用肝毒性化合物并用多元统计分析 处理尿液 NMR 数据，分辨给药组和空白组代谢物组的区别，并进一步确定这种 区别来源于三羧酸循环中问体的损耗及尿液中链状二羧酸的出现。Holmes 等 I 以肼作为肝毒性模型药物， 以氯化汞作为肾毒性模型药物，采用 SD 和 Wistar 两种品系大鼠为试验动物，用代谢组学方法同时比较种系间代谢物组差 异和毒性对代谢物模式的影响，通过大鼠尿液代谢物组数据的前 3 个主要成分 对各组大鼠进行分类，98的测试样本得到了正确的分类。Robertson 等 。l 采用四氯化碳和 一萘基异硫氰酸盐作为肝毒性建模药物，2 一溴乙胺和 4 一氨 基酚作为肾毒性药物进行了类似研究，用 PCA 处理结果表明代谢物组方法可以 方便地区分毒性的发生和逆转。通过代谢组学进行毒价评价可以帮助人们更好 地了解生物系统对环境和遗传因素变化的反应。从而对动物的健康做出正确评 价，有助于动物医学事业的发展。 23 在兽药检测中的研究应用 随着兽药在畜牧生产中的广泛应用以及人们对 肉、奶、蛋安全的要求，对兽药的分析技术的需求也更加迫切并取得较大的发 展。雷红涛等 剀用甲硝唑与琥珀酸酐反应， 合成半抗原甲硝唑半琥珀酸酯， 用 HNMR 等方法进行鉴定。结果成功合成全抗原，为进一步制备甲硝唑抗体 从而治疗鸡、火鸡组织滴虫病、牛毛滴虫等病奠定了基础。彭莉等 r3oN 用气 相色谱法测定牛奶中的氯霉素残留，结果表明，回收率、批间变异系数、检测 限和定量限均达到了欧盟的规定要求，适合牛奶中氯霉素的残留分析。田苗等 u 利用 GCMS 检测技术，建立了猪组织(肉组织、肝脏和肾脏)中 1O 种 B 一兴 奋剂类兽药残留量的检测方法，结果显示，l0 种 B 一兴奋剂类兽药的检出限、 回收率和精密度等技术指标能满足国内外对 B 一兴奋剂类兽药残留量的检测要 求。孙雷等建立了猪肉组织中 7 种氟喹诺酮类药物残留检测的高效液相色谱一 串联质谱方法，分析结果表明，该方法特异性强、回收率高、变异系数小、检 测限和定量限低。 通过代谢组学研究可以在兽药的新药遴选、药物毒性评价、不良反应监测方面 提供一定的向导性，对动物的健康起到了举足轻重的作用。 3 结论 代谢组学技术可以应用于生命系统的多项研究中，尤其在诊断动物疾病中的应 用对人类社会的发展起到了不可或缺的作用。但在广泛应用的同时也存在很多 问题，如分析技术有限，不能应用于全部代谢物，仪器昂贵对操作技术要求较 高， 尚无有效的数据分析手段将所得到的全部信息进行分析和解释，数据库很 不完善。另 J,f-H 何把代谢组学数据和转录组学、蛋白质组学、遗传学、酶学、 代谢途径和表现型分析的数据整合在一起，并给出生物学功能的解释将是最大 的挑战。 4 展望 代谢组学是系统生物学的重要组成部分，随着现代科学技术的迅猛发展，代谢 组学的