化疗对乳腺癌患者外周血淋巴细胞亚群及cd4+cd25+cd127-调节性t细胞的影响

化疗对乳腺癌患者外周血淋巴细胞亚群及 CD4+CD25+CD127-调节性 T细胞的影响 康文喜 樊 静 河北省秦皇岛市第四医院 邮编：066001 摘要： 目的 探讨化疗对乳腺癌患者外周血 CD4+CD25+CD127-调节 性 T 细胞及 T、B 、NK 淋巴细胞亚群的动态变化及其临床意义。方 法 采用流式细胞仪术分析 129 例乳腺癌患者 CD4+CD25+CD127-调 节性 T 细胞 水平及 CD3、CD4、CD8、NK 、B 细胞和 CD4/CD8 比值 的动态变化，并进行化疗前后、组织类型和 TNM 分期的对比分析。 结果 化疗后乳腺癌患者 CD4+CD25+CD127-调节性 T 细胞比率降低， CD3、 CD4、CD4/CD8 值增高，CD8 、 NK 和 B 细胞亚群降低 ；调 节性 T 细胞的数量与临床分期和组织分化程度有关。 结论 乳腺癌患 者化疗后的免疫调节抑制功能下降，免疫功能得到提高，但体液免疫 及 NK 功能未见提高。 关键词 乳腺癌 化疗 CD4+CD25+CD127-调节性 T 细胞 流式细 胞术 目前化疗是乳腺癌的主要治疗手段，也是规范化治疗的重要组 成部分。由于化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会损害正常细胞 包括免疫细胞，从而影响患者的免疫功能。CD4 +CD25+ 调节性 T细胞 （T regulatory cell，Treg）是体内重要的抑制性免疫调节 T细胞， 正常情况下主要参与维持免疫稳定，抑制自身免疫疾病的发生；在 肿瘤免疫耐受机制中发挥关键的作用 1。本文通过检测乳腺癌患者 化疗前后外周血 CD4+CD25+ CD127-调节性 T细胞及 T淋巴细胞各亚群 变化，分析化疗对机体免疫功能的影响，探讨 Treg与肿瘤及临床转 归的关联性,为乳腺癌的治疗提供新的理论依据。 1.1 研究对象 本组129例均为我院2009年2月-2010年12月经病理确诊的手术后乳腺癌患者， 年龄2765岁，平均年龄（41.236.71）岁，无自身免疫疾病，治疗前未使用过任何免疫调 节剂和免疫抑制剂等影响免疫功能的药物。 1.2 主要试剂及仪器 流式细胞仪EPICS XL为美国 BECKMAN COULTER 公司产品。CD3- PC5、CD4-FITC、CD8-PE、CD19-FITC、CD16-FITC、CD56-PE 、CD3-PC5 、CD4-PC5、CD25- FITC CD127-PE荧光标记单克隆抗体、同型对照 IgG1或 IgG2荧光抗体、红细胞裂解液等试 剂均为美国贝克曼库尔特（BECKMAN COULTER）公司出品。 1.3 实验方法 所有观察对象均于化疗前 1天，化后 1周清晨空腹抽取静脉血 2ml，EDTA-2K 抗凝，使用直接免疫荧光标记法标记细胞并进行流式细胞仪分析。操作步骤：取不同荧光标 记的单克隆抗体各 2 0l 分别加入 100l EDTA-2K抗凝的外周血，室温下孵育 15分钟， 再加入红细胞裂解液孵育 10 分钟，离心 1500转/5 分钟，加入 PBS 2ml洗两次，弃上清后 加入适量的 PBS，混匀后上机检测。 1.4.化疗药物：采用紫杉类+蒽环类联合化疗。 1.4 统计学处理 实验结果应用SPSS13.0统计分析软件，采用t检验进行统计学分析，统计 学差异确定为 p0.05。 2.结果 2.1 乳腺癌患者化疗前后 CD4+CD25+CD127-/CD4+T比率变化（见表 1）：化疗前患者调节性 T细胞比率为 4.651.38,化疗后调节性 T细胞为 2.431.06，检测结果显示化疗后调节性 T细胞水平较化疗前明显降低，差异具有统计学意义。 表 1. 化疗前后调节性 T细胞比率变化 2.2 乳腺癌患者化疗前后淋巴细胞亚群数值的变化（见表 2）： 表 2 显示，CD3、CD4、CD 4/CD8化疗后较化疗前测定结果均增高，CD8、CD16/56 、CD19 化疗后较化疗前均降低。 分析对象 n CD4+CD25+CD127-/CD4+T % 化疗前患者 化疗后患者 129 129 4.651.38 2.431.06 P 值 0.01 表 2 129例乳腺癌患者治疗前后淋巴细胞亚群的比较 2.3 乳腺癌中 CD4+CD25+CD127-/CD4+ T比率在不同组织学类型的变化（见表 3）:结 果显示，恶性程度高的浸润性导管癌 CD4+CD25+CD127-/CD4+ %比率明显高 于恶性程度低的管内癌（见表 3） 。 表 3 乳腺癌不同组织学类型 Treg数值的比较 2.4 乳腺癌在不同 TNM分期中 CD4+CD25+CD127-/CD4+ %比率变化 期明显 高于-期（见表 4） 。 表 4乳腺癌不同 TNM分期中 Treg数值的比较 3.讨 论 乳腺癌是严重影响妇女身心健康甚至危及生命的常见恶性肿瘤之一,占我 国各种恶性肿瘤的 7% 10% 2。研究表明肿瘤的发生与进展是肿瘤细胞逃避免 疫监视的结果, 肿瘤通过释放和诱导免疫抑制因子如 IL-10、TGF-、IDO 等； 诱导抑制性免疫细胞如调节性 T细胞（Treg）、抑制性抗原呈递细胞、抑制性 组 别 n CD4 CD8 CD3 CD4/CD8 CD16+56 CD19 化疗前 129 36.54.9 29.59.0 65.9.7.8 1.200.33 13.97.6 8.15.6 化疗后 129 40.94.9 27.59.2 79.67.8 1.440.63 10.66.7 7.04.8 P值 0.01 0.05 0.05 0.01 0.01 0.05 组织类型 CD4+CD25+CD127-/CD4+T % 浸润性导管癌 髓样癌 管内癌 4.21 1.23 3.870.85 2.531.47 P 值 0.01 TNM分期 CD4+CD25+CD127-/CD4+T % - 3.450.83 4.561.65 5.821.74 P 值 0.01 CD4和 CD8细胞等；抑制免疫细胞活化和效应机制，如抑制 CD28和 HLA等分子 表达，抑制 r-干扰素等效应分子表达和作用等。因此，免疫学机制在肿瘤发生 与发展及抗肿瘤中都具有十分重要的作用 3-8。 细胞免疫在肿瘤免疫中起关键作用，而T淋巴细胞是细胞免疫的主要组成 部分，具有多样化的T淋巴细胞与功能亚群成份在免疫网络调控中发挥重要功 能。根据T 淋巴细胞表面分化抗原(Cluster of differentiation ,CD) 分子 的不同,可将T 细胞划分为Th 细胞(CD3 +CD4+)和Ts 细胞(CD3 +CD8+) 。Th 细胞 不仅可以分泌大量的细胞因子和辅助Ts 细胞杀伤肿瘤细胞,而且具有免疫记忆 和直接杀伤肿瘤细胞的功能。Ts 细胞是效应阶段的免疫细胞,通过释放效应分 子如穿孔素、颗粒酶、r-干扰素或促使细胞凋亡等机制杀伤靶细胞（如肿瘤细 胞）。NK细胞是非抗原依赖性免疫效应细胞,它不经致敏可直接杀伤敏感的肿 瘤细胞。主要表面标志是CD16和CD56, CD16 表达于未成熟NK细胞表面,CD56 则在成熟NK细胞表面。这些免疫细胞形成了细胞免疫包括肿瘤免疫的物质基础 ，因此，其数量和功能的改变将影响肿瘤免疫的发挥。本研究显示:乳腺癌患 者外周血总T 细胞（ CD3）、Th细胞(CD3 +CD4+)和CD4/CD8比值在化疗后均高于 化疗前，提示化疗明显改变了体内的免疫状态，而Th细胞增高提示化疗后肿瘤 负荷减少，能一定程度恢复细胞免疫调控能力。一定比例的病人CD8细胞和NK 细胞低于治疗前，提示化疗后免疫细胞亚群乃至功能有再分布，其免疫学和临 床意义有待于更深入研究。 在诸多的肿瘤免疫逃避相关机制中，调节性 T细胞诱导增高和作用增强 是最重要因素之一。CD4 +CD25+Treg是一类具有独特免疫调节功能的 T淋巴细胞 亚群 3，于 1995年首次分离成功，是 CD4+ T 细胞的一个重要亚群 9-12。近 年来的研究表明，许多肿瘤有 Treg诱导增高现象。本研究显示，乳腺癌患者 外周血 CD4+CD25+调节性 T细胞也有明显增高现象，其增高程度与文献报道结果 一致。本研究还发现，在乳腺癌不同组织学类型中，Treg 调节性 T细胞的表达 亦有所不同，在乳腺浸润性导管癌，CD4 +CD25+CD127-调节性 T细为 4.21 1.23，而在乳腺管内癌 CD4+CD25+CD127-调节性 T细胞为 2.531.47。两者相 比，恶性程度高者其 CD4+CD25+CD127-调节性 T细胞水平明显高于恶性程度低的 管内癌。在乳腺癌不同 TNM分期中，CD4 +CD25+CD127- 调节性 T细胞的数值亦 有不同：-期 Treg调节性 T细胞的数值为 3.450.83，期 Treg调节性 T细胞的数值为 4.561.65， 期 Treg调节性 T细胞的数值为 5.821.74。 结果显示 Treg调节性 T细胞的数值与 TNM分期成正相关，与转移及预后呈负 相关。乳腺癌的恶性程度与 Treg细胞数目之间存在着密切关系。引起 Treg细 胞数目增高可能的机制是，肿瘤细胞和肿瘤浸润，刺激周围的巨噬细胞释放 CCR4和 H-铁蛋白，导致肿瘤微环境中 CCR4+天然 Treg细胞数目增高。CCR4 +天 然 Treg与 PGE2的致耐受的 DC接触后，外周血中天然 Treg转化为记忆性 Treg，导致外周血中 Treg细胞数目增高。当 Treg细胞增高后，联合致耐受的 DC，从而抑制效应 T细胞的产生，导致机体抗肿瘤耐受 13 。 化疗对 Treg调节性 T细胞的表达有显著影响，129 例中化疗前患者 CD4+CD25+CD127- Treg调节性 T细胞的表达为 4.61.4，化疗后患者 Treg调 节性 T细胞的表达为 3.41.3， P 值0.01。 上述结果提示，Treg 细胞诱导增高也是乳腺癌诱导免疫耐受的机制之一， 而动态观察乳腺癌患者外周血 CD4+CD25+Treg细胞水平，能一定程度预测肿瘤 免疫耐受作用。同样，通过各种治疗手段下调 CD4+CD25+ Treg比例和抑制其作 用将有利于机体肿瘤免疫功能的发挥，或许是一种有效地治疗乳腺癌的新方法。 总之, 化疗对肿瘤患者细胞免疫状态能产生实际性影响，主要是提高了Th 细胞的作用，但其免疫学和临床意义有待于进一步研究。乳腺癌患者同样有调 节性T细胞的诱导增高，表明Treg也是乳腺癌诱导免疫耐受的机制之一。 4.参考文献 1.Stephens LA, Barclay AN, Mason D. 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