帕金森病大鼠模型多巴胺转运蛋白125i-β-cit放射自显影研究

帕金森病大鼠模型多巴胺转运蛋白 125I-CIT 放射自显影研究 【摘要】 目的 探讨 125I-CIT甲基-3-（4-碘苯基）托烷-2-羧酸盐多巴胺转运蛋白 （DAT）显像技术的临床应用价值。方法 应用 6-羟基多巴胺（6-OHDA）建立黑质部分损毁及完全损毁偏 侧帕金森病（PD）大鼠模型。静脉注射 125I-CIT 40 Ci 进行放射自显影。高效液相-电化学法检测 纹状体多巴胺（DA）及其代谢产物含量。免疫组化酪氨酸羟化酶（TH）染色观察黑质及纹状体 TH 阳性细 胞及纤维。结果 黑质部分损毁及完全损毁偏侧模型损毁侧纹状体 125I-CIT 放射活性分别为 2.670.25 和 0.980.29，较未损毁侧分别降低 18%和 72%， DA 含量分别降低 39%和 98%。TH 染色可见 损毁侧黑质及纹状体 TH 阳性细胞及纤维明显少于对侧。结论 DAT 的显像研究可能有助于 PD 早期诊断及 病情监测。 Autoradiographic study of dopamine transporter in rat models of Parkinson disease with 125I-CIT LIU Zhenguo CHEN Shengdi， SUN Wenshan，et al Department of Neurology， Ruijin Hospital， Clinical and Research Center for Parkinson Disease， ShanghaiSecond Medical University， Shanghai 200025 China 【Abstract】 Objective To study the value of imaging for dopamine transporter（DAT） with 125I-CIT Methods The rat models of hemiparkinsonism with either partial or complete lesions were rendered with 6-hydroxydopamine （ 6-OHDA） Each rat was injected intravenously with 125I-CIT containing 40Ci Coronal tissue sections were imaged by autoradiography The levels of dopamine （DA） and its metabolites were measured by high performance liquid choromatography and electrochemical detection （HPLC-ECD） The tyrosine hydroxylase（TH）-positive cells and fibres in the substantia nigra and striatum of the rats were observed with immunohistochemical stainingResults The radioactivities in the lesions of the striatum of both partial and complete hemiparkinsonian lesions of the rat models were 2670.25 and 0980.29，respectively ，and were singificantly decreased by 18% and 72%，respectively， as compared with those on the side without lesions The levels of DA in the lesions of the striatum of partial and complete rat models were decreased by 39% and 98%， respectively The loss of TH-positive cells and fibres in the substantia nigra and striatum was found in the lesions of the striatum of both partial and complete hemiparkinsonian rat models Conclusion The imaging study of DAT may be helpful for the early diagnosis of Parkinsons disease and for the monitoring of the progression of this disease 【Key words】 Carrier proteins； Parkinson disease； 125I-CIT； Autoradiography 帕金森病（Parkinson disease，PD）病理基础是中脑黑质多巴胺（DA）能神经元及黑质纹状体通路 变性死亡。中枢多巴胺转运蛋白（DAT） 位于 DA 能神经元突触前膜。中脑黑质 DA 能神经元变性将累及纹 状体部位 DA 能神经终末 DAT 的密度。DAT 密度的改变与 DA 能神经元数量的变化相一致1。黑质 DA 能神 经元数量可以通过 DAT 功能显像进行半定量检测，为临床 PD 辅助诊断提供一种手段。 材料和方法 1黑质部分和完全损毁 PD 大鼠模型制备2：SD 大鼠 60 只，雄性，体重 200250 g。取 20 只大鼠， 借助大鼠脑立体定向仪，将 6-羟基多巴胺（6-OHDA）溶液 12 g/6 l 分 2 点注射至大鼠右侧黑质致密 部，坐标定位：1 点为前囟后 5.0 mm，旁正中 1.9 mm，硬膜下 7.1 mm；另 1 点为前囟后 5.0 mm，旁正中 2.3 mm，硬膜下 6.8 mm。23 周后腹腔注射阿朴吗啡（APO） 01 mg/kg 体重，取 APO 诱发旋转次数小 于 3 转/min 者作为黑质部分损毁模型。取另外 40 只大鼠，在上述黑质部位注射 2 点的基础上，于内侧前 脑束（MFB）注射 8 g/4 l 6-OHDA，坐标为：前囟后 4.4 mm，旁正中 1.7 mm，硬膜下 7.7 mm。将 APO 诱发的旋转次数大于 7 转/min 者作为黑质完全损毁模型。 2125I-CIT甲基-3-（4-碘苯基）托烷-2-羧酸盐的标记3：采用氯胺-T 法标记 125I- CIT，标记率为 75%80%，放射化学纯度95%。 3模型动物脑放射自显影：取正常大鼠、黑质部分损毁及完全损毁模型大鼠各 6 只，经尾静脉注射 取 125I-CIT 40 Ci，于注射后 4 h 断颈取脑，冰冻切片，与 GS-250 自显影仪扫屏显像曝光 8 h，用 图像分析系统对每只大鼠两侧相同的纹状体区分析 46 张脑片。对每张脑片图像的两侧纹状体及额叶皮 层相对称的部位选取 1 个相同形状及面积大小的感兴趣区（ROI），对每个 ROI 进行光灰度测定，并计算 各组同侧纹状体/皮层（ST/CX）灰度的比值，取其平均值，这一比值代表纹状体的相对放射计数，亦代表 其 DAT 密度，可反映其纹状体 DA 能神经末梢以及黑质 DA 能神经元数目的变化。 4高效液相-电化学法检测（HPLC-ECD）模型动物 DA 及其代谢产物含量：每组各取 4 只大鼠，麻醉 后断头，在干冰上分离出双侧纹状体并称重，HPLC-ECD 检测。 5模型动物黑质及纹状体免疫组化染色：每组各取 1 只，经 4%多聚甲醛灌注后，于纹状体和黑质部 位冰冻切片，片厚 50 m，进行免疫组化 ABC 法酪氨酸羟化酶（TH）染色。 6统计学处理：组内左右侧及组间比较采用 Student t 检验。 结果 1动物脑组织放射自显影观察：正常大鼠纹状体区冠状位图像清楚可见纹状体部位有放射性浓集， 左、右侧灰度相当。皮层、伏隔核以及黑质部位亦有轻度放射性浓集。黑质部分损毁及完全损毁模型损毁 侧纹状体放射性浓集降低，黑质完全损毁模型降低更明显（图 1）。黑质部分损毁模型右侧 ST/CX 比值较 左侧降低了 18%；黑质完全损毁模型降低了 72%。从表 1 中可以看出模型动物左右侧纹状体之间 ST/CX 比 值存在显著性差别，随着损毁程度加重，DAT 密度降低明显，表明 DAT 密度降低程度与损毁程度成正比， -CIT DAT 功能显像可以反映早期黑质纹状体系统的病理变化及变化程度。 表 1 125I-CIT 在 PD 大鼠模型脑内 ST/C 比值及 各组间比较（ s） 组别 鼠数 未损毁侧 损毁侧（右侧） （只） （左侧） 对照组 6 3.600.15* 3.630.40 黑质部分损毁组 6 3.250.39* 2.670.25 黑质完全损毁组 6 3.450.49* 0.980.29 注：同组左、右侧比较 * P0.05 * P0.005； 与正常组同侧相比 P0.001 2DA 及其代谢产物含量：从表 2 可见，黑质部分损毁模型损毁侧（右侧）多巴胺（DA）、二羧苯乙 酸（DOPAC）和 3-甲氧-4-羧基苯乙酸（HVA）较左侧分别减少 39%、41%和 70%；黑质完全损毁模型右侧比 左侧分别减少 98%、96%和 97%。表明部分损毁模型的 DA 生化能代表 PD 早期的生化改变。 表 2 HPLC-ECD 检测大鼠离体纹状体 DA、DOPAC、 HVA 的含量（ s g/g 湿组织） 组别 鼠数 （只） DA DOPAC HVA 对照组 4 左侧 2.971 0194 0.866 0125 0.986 0080 右侧 3.039 0184 0.956 0146 1.056 0267 黑质部分损毁组 4 未损毁侧（左侧） 2.897 0213 1.034 0218 1.089 0327 损毁侧（右侧） 1.759 0408* 0.612 058 0.328 025* 黑质完全损毁组 4 未损毁侧（左侧） 2.831 0204 0.965 0087 0.853 0078 损毁侧（右侧） 0.043 0018* 0.037 0014* 0.028 0011* 注：同组左右侧相比 * P0.05， * P0.001；与正常组同侧相比 P0.05， P0.001 结合 125I-CIT 在 PD 大鼠放射自显影图像的灰度测定值，可以发现在部分损毁模型生化改变早期，DA 含量降低 39%时 DAT 自显影图像即可显示出左右侧差别。 3TH 免疫组化：在黑质部分损毁及完全损毁的 PD 模型上，6-OHDA 未损毁侧（左侧）黑质致密带内 可见密集的 TH 阳性细胞呈棕褐色，网状带内以及腹侧背盖（VTA）亦可见一些 TH 阳性细胞，左侧纹状体 部位可见细而密集的 TH 阳性纤维。黑质部分损毁 PD 模型的损毁侧黑质致密带以及网状带尚存在一些 TH 阳性细胞，以网状带为多，纹状体亦见到相对密集的 TH 阳性纤维。在黑质完全损毁 PD 模型的损毁侧（右 侧）黑质致密带以及网状带未见 TH 阳性细胞，VTA 部位有少量 TH 阳性细胞，纹状体部位仅有少许细而稀 疏的 TH 阳性纤维（图 2）。 讨论 DAT 是位于纹状体 DA 能神经元突触前膜的一种膜蛋白，DAT 密度的改变与 DA 神经元数量的变化相一 致。1993 年有人用 123I-CIT 单光子发射计算机体层摄影术（SPECT）检测正常人和 PD 患者 DAT 功能 显像，证实 PD 患者 DAT 下降4。 文献报道 PD 初期的壳核 18F-Ddopa 摄取率降低 30%，表明 18F-Ddopa 正电子发射体层摄影术（PET） 可以在 PD 亚临床期检测黑质 DA 能神经元的功能5。同时，也有资料表明早期 PD 患者基底节 DAT 功能较 正常人降低 31%65%，因此，DAT PET 或 SPECT 检测有助于 PD 早期诊断，甚至，可用于亚临床期 PD 的筛 查。Marek 等6应用 123I-CIT SPECT 检查 8 例早期偏侧 PD 患者和 8 名年龄、性别与 PD 患者相当的 健康正常人，发现偏侧 PD 患者基底节 DAT 水平在有症状肢体对侧和同侧分别降低约 53%和 38%，且壳核 DAT 水平降低比尾核明显，表明 123I-CIT SPECT 有助于 PD 早期甚至亚临床期的诊断。利用 DAT 功能 状态观察 PD 严重程度则是根据 PD 患者的临床功能评分来进行比较，但临床上无法结合纹状体部位生化和 病理与 DAT 功能相匹配研究 PD 的早期病情及病情发展。 本实验建立的黑质部分和完全损毁偏侧 PD 模型，损毁侧纹状体 DA 含量分别降低 39%和 98%。免疫组 化染色可见纹状体和黑质 TH 阳性纤维和神经元相应地稀疏及缺失，可模拟 PD 早期及晚期病理、生化改变。 应用 125I-CIT 放射自显影研究了黑质部分及完全损毁的 PD 大鼠模型，并结合离体生化和 TH 免疫组化 进行 DA 及其代谢产物检测和 DA 能神经元及其纤维形态学观察，发现当黑质部分损毁侧纹状体的 DA 含量 较未损毁侧降低 40%时，125I-CIT 在纹状体部位的放射性浓集程度均见降低，与纹状体 DA 含量降低及 TH 免疫组化观察到 TH 阳性纤维稀疏程度相一致。表明 125I-CIT 显像不仅有助于 PD 早期诊断，而且 可以用于病情监测，为 123I-CIT SPECT 显像的临床应用提供了理论依据。 PD 大鼠脑纹状体 125I-CIT 放射自显影， a：正常大鼠，两侧纹状体可见放射性浓集， b：部分 损毁偏侧大鼠，损毁侧纹状体放射性浓集程度明显减弱， c：完全损毁偏侧大鼠，损毁侧纹状体放射性浓 集程度更加降低 图 2 PD 大鼠损毁侧纹 状体显示部分和完全损毁大鼠纹状体稀疏的 TH 阳性纤维， a：正常对照， b：部分损毁， c：完全损毁 TH 免疫组化染色80 基金项目：国家重点基础研究规划“脑功能和脑重大疾病基础研究”资助项目（G1999054000）；上 海市卫生系统百名跨世纪优秀学科带头人培养计划资助项目（97BR001）；上海市科委青年科技“启明星” 计划资助项目（97QMB1410、99QB14023）；上海市教委基金资助项目（99B08） 参考文献 1Kaufman MJ，Madras BKSevere depletion of cocaine recognition sites associated with the dopamine transporter in Parkinsons-diseased striatumSynapse，1991，49：43-49 2Carman LS，Gage FH，Shults CWP