常见致病菌的检测

常见致病菌的检测 摘要：近年来食品药品安全的问题屡见不鲜，做好致病菌的检测，是防范于 未然的措施，因而显得尤为的重要，也越来越受到人们的重视。这就要求我们 对一些常见的致病菌检测技术的要有一定的了解。 关键词：致病菌，肠球菌，霉菌和酵母菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌。 一. 肠球菌 （1） 、形态与染色【1】 肠球菌为革兰阳性（G+）球菌,广泛分布于自然环境及人和动物消化道内。 20 世纪 80 年代以来，肠球菌严重感染的发生率和病死率明显升高，并且由于 肠球菌的固有耐药和获得性耐药，使许多常用抗菌药物在治疗肠球菌感染时失 败。因此，从分子水平对肠球菌致病因子、肠球菌引起的感染机制与治疗的研 究显得尤为重要。肠 球 菌 为 圆 形 或 椭 圆 形 、 呈 链 状 排 列 的 革 兰 阳 性 球 菌 ， 无 芽 胞 ， 无 鞭 毛 ， 为 需 氧 或 兼 性 厌 氧 菌 。 本 菌 对 营 养 要 求 较 高 ， 在 含 有 血 清 的 培 养 基 上 生 长 良 好 。 （3）致病性【1】 一 般 而 言 ， 肠 球 菌 的 毒 力 不 高 。 与 金 黄 色 葡 萄 球 菌 和 化 脓 性 链 球 菌 相 比 ， 肠 球 菌 对 大 多 数 动 物 的 半 数 致 死 量 （ LD50） 值 相 当 高 ， 而 且 肠 球 菌 很 少 引 起 蜂 窝 织 炎 和 呼 吸 道 感 染 。 肠 球 菌 只 有 在 宿 主 组 织 寄 殖 ， 耐 机 体 非 特 异 及 免 疫 防 御 机 制 ， 并 引 起 病 理 改 变 ， 才 能 导 致 感 染 。 粘 附 测 定 显 示 肠 球 菌 可 通 过 细 菌 表 面 表 达 的 为 粘 附 素 ， 吸 附 至 肠 道 、 尿 路 上 皮 细 胞 及 心 脏 细 胞 。 这 些 粘 附 素 的 表 达 亦 受 细 菌 生 长 环 境 的 影 响 。 另 外 ， 肠 球 菌 可 产 生 一 种 聚 合 物 质 （ 系 一 种 蛋 白 表 面 物 质 ， 可 聚 集 供 体 与 受 体 菌 ， 以 利 质 粒 转 移 ） ， 在 体 外 增 强 其 对 肾 小 管 上 皮 细 胞 的 粘 附 。 细 菌 生 长 环 境 亦 影 响 肠 球 菌 与 多 形 核 白 细 胞 反 应 。 血 清 中 生 长 的 肠 球 菌 与 多 形 核 白 细 胞 反 应 较 弱 ， 而 肉 汤 中 生 长 的 细 菌 反 应 较 强 。 体 外 多 形 核 白 细 胞 对 肠 球 菌 的 有 效 杀 灭 作 用 需 血 清 补 体 蛋 白 参 与 ， 而 抗 肠 球 菌 抗 体 可 增 强 该 作 用 。 （4） 、肠球菌属主要检测步骤如下：【2】 方法一：肠球菌平板计数法检验程序 25g (mL) + 225 mL 缓冲蛋白胨水 10 倍梯度稀释 选择 2 个3 个适宜连续稀释度，各取 1 mL 分别加入灭菌培养皿 KF 琼脂 36 士 1 48h 士 2h 肠球菌琼脂 35士 2 24h 士 2h 确证实验 肠球菌阳性 菌落计数及计算 报告结果 方法二：肠球菌最近似值（MPN ）测定法检验程序 25g（mL ) + 225 mL 缓冲蛋白胨水 10 倍梯度稀释 选择 3 个适宜连续稀释度，各取 1 ml 分别加入肉汤中 叠氮化钠葡萄糖肉汤管 肠球菌肉汤管 37 士 1 , 24h48h 35C 士 2 24h 士 2h 无混浊 混浊 变黑 不变黑 肠球菌阴性 确证实验 确证实验 肠球菌阴性 肠球菌阳性 肠球菌阳性 MPN 值法报告肠球菌数g(mI) 二霉菌和酵母菌 （1） 、形态【1】 酵母菌是单细胞真核微生物。酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠 形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。比细菌的单细胞个体要大得多，一般为 1-5 微米5-30 微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。其具有典型的真核细胞结构，有 细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。 霉菌是丝状真菌的俗称，意即“发霉的真菌”，它们往往能形成分枝繁茂的 菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品 上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌。霉菌的菌 丝。构成霉菌营养体的基本单位是菌丝。菌丝是一种管状的细丝，把它放在显 微镜下观察，很像一根透明胶管，它的直径一般为 3-10 微米，比细菌和放线菌 的细胞约粗几倍到几十倍。菌丝可伸长并产生分枝，许多分枝的菌丝相互交织 在一起，就叫菌丝体。根据菌丝中是否存在隔膜，可把霉菌菌丝分成两种类型： 无隔膜菌丝和有隔膜菌丝。 （2）霉菌和酵母菌主要检测步骤如下【3】 检样 21ml 样品225ml 无菌蒸馏水，均质 10 倍系列稀释 选择 2 个3 个适宜连续稀释度，各取 1 mL 分别加入灭菌培养皿 每皿中加入 1520mlm 马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基 28 士 1 5d 菌落计数及计算 报告结果 三金黄色葡萄球菌 （1）.生物学特性【4】 典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径 0.8m 左右，显微镜下排列成葡萄串 状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色 葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生 长温度 37C，最适生长 pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径 1- 2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性， 可在 10-15%NaCl 肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产 气。甲基红反应阳性，VP 反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还 原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感 性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。 （2）致病性【2】 a.溶血毒素：外毒素，分 、 四种，能损伤血小板，破坏溶酶体， 引起肌体局部缺血和坏死； b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤 维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感 染易局部化与此酶有关； d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温， 可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌； e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素， 分为 A、B、C、D、E 及 F 五种血清型。 （3）.金黄色葡萄球菌主要检测步骤如下【5】 25g（mL ) + 225 mL 生理盐水或磷酸盐缓冲液 10-1 稀释液接入 7.5%NaCl 肉汤或胰蛋白胨肉汤 37 士 1 18h24h Baird-Parker 平板，血平板 37 士 1 血平板 18h24h ，Baird-Parker 平板或 15h48h 涂片染色 观察溶血 BHI 肉汤和营养琼脂小斜面 血浆凝固酶试验 报告 四沙门氏菌检验 （1）.生物学特性【6】 沙门氏菌属(Salmonella)是肠杆菌科的一个大属，有 2000 多个血清型，我 国发现的约有 100 个。沙门氏菌广泛存在于猪、牛、羊、家禽、鸟类、鼠类等 多种动物的肠道和内脏中。1880 年 Eberth 首先发现伤寒杆菌，1885 年 Salmon 分离到猪霍乱杆菌，由于 Salmon 发现本属细菌的时间较早，在研究中的贡献较 大，遂定名为沙门氏菌属 Salmonella 。 （2）.沙门氏菌的致病性 本属细菌绝大多数成员对人和动物有致病性，能引起人和动物的败血症与 胃肠炎，甚至流产，并能引起人类食物中毒，是人类细菌性食物中毒的最主要 病原菌之一。 【2】沙门氏菌经口进入人体以后，在肠道内大量繁殖，经淋巴系统 进入血液，造成一过性菌血症，即感染过程。随后，沙门氏菌在肠道和血液中 受到机体的抵抗而被裂解、破坏，释放大量内毒素，使人体中毒，出现中毒症 状。 （3）. 沙门氏菌主要检测步骤如下【7】 检样 25 g（mL）样品+225 mLBPW 36 1 ，8 h18 h 1 mL+TTB 10 mL 1 mL+SC 10 mL 42 1 ，18 h24 h 36 1 ，18 h24 h BS XLD（或 HE、显色培养基） 36 1 ，40 h48 h 36 1 ，18 h24 h 挑取可疑菌落 TSI，赖氨酸，NA， 靛基质， 尿素 (pH 7.2)，KCN 生化鉴定试剂盒或全 H2S+ 靛基质- H2S+ 靛基质+ H2S-靛基质-尿 反应结果与左 自动微生物生鉴定 尿素-KCN- 尿素- KC 素-KCN- 侧描述不符 系统 赖氨酸 + 赖氨酸 + 赖氨酸 + 甘露醇+、山梨醇+ ONPG- 沙门氏菌，血清学试验 非沙门氏菌 报告 五 .常见致病菌的检测的意义 随着生活水平的提高，食品药品安全的概念在国人的意识中也有了一定的 变化。过去的食品药品安全，主要集中表现为食品与药品量的安全，就是吃饱 能治病的问题，所以有“ 深挖洞，广积粮”的说法。而现代社会基本上已经解决 了温饱问题，国人对食品与药品安全的理解，更多地关注食品与药品“质”的安 全。这是一个大的飞跃。 而食源性致病菌的危害是食品与药品安全的一个重要 方面，在食品卫生控制中有重要的意义