干细胞的应用及研究方向

干细胞的应用及研究方向 摘要 干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体。近年来干细胞的应用几乎涉及到 所有生命科学和生物医学领域。本文概述了干细胞的生物学特性，并综述了干细胞的可塑性、 分离培养及其在基础研究及临床上的应用的研究进展。最后，展望了今后研究的方向。 干细胞（stem cells）是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，即这 些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织 细胞，从而医学界称之为“万用细胞”。1981 年英国的 Evans 和 Kaufman 用延缓着床的胚泡首 次成功地分离了小鼠胚胎干细胞,从而在全球掀起了有关干细胞的研究热潮。1997 年 2 月英国苏 格兰罗斯林研究所威尔穆特博士等成功克隆出“多利”绵羊，1998 年 11 月,美国 Thomson1 和 Gearhart2分别用不同的方法获得人胚胎干细胞及胚胎生殖细胞,此后,干细胞的研究便进 入了一个全新的时代。1999 年，有关干细胞的研究被 Science 评为 1999 年度十大科学进展之首。 2000 年 12 月干细胞研究再次被科学杂志评为该年度世界十大科学成就之一。本文就近几年 来干细胞的研究进展综述如下。 1 干细胞的生物学特性 根据干细胞的发育阶段，可将其分为胚胎干细胞和成体干细胞（Adult Stem Cell，AS）。 胚胎干细胞即具有分化为机体任何一种组织器官潜能的细胞,包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞 （Embryonic Germ Cell，EG）。成体干细胞即具有自我更新能力,但通常只能分化为相应组织 器官组成的“专业”细胞,它是存在于成熟个体各种组织器官中的干细胞,包括神经干细胞、血 液干细胞,骨髓间充质干细胞、表皮干细胞、肝干细胞等。 1.1 胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞最早是直接从小鼠早期胚胎分离建系的,它们具有其自身的生物学特性。与其他 细胞系相比较, 胚胎干细胞的特点在于:（1）具有不断增殖分化的能力，所以，在体外培养条 件下可以建立稳定的干细胞系，并保持高度未分化状态和发育潜能性。1999 年 Soiter 等3 利用这个特性将 ES/EBs 及其分化细胞作为有关药物的针对筛选系统,进行药物毒性检测实验。 （2）具有高度的发育潜能和分化潜能。体内外可分化出外、中、内三个胚层的分化细胞，可以 诱导分化为成体细胞内各种类型的组织细胞。胚胎干细胞含有正常二倍染色体，具有种系传递 功能,能广泛参与宿主胚胎各组织器官的生长发育,并形成包括生殖系在内的合体后代生殖细胞。 1995 年 Pacacio 等4利用骨髓基质细胞或其培养液,将胚胎干细胞在体外诱导分化为造血干 细胞。1997 年 Baker 等5在缺乏新霉素(geneticin,g418)的条件下,将 Rosa-geo 基因转染 胚胎干细胞后能在体外诱导分化为软骨细胞。同年 Deni 等报告将胚胎干细胞通过悬滴培养可分 化出脂肪细胞。（3）能进行体外培养扩增,还可以对其进行遗传操作选择, 如导入异源基因、 报告基因或标志基因，诱导某个基因突变等。扩增、遗传操作及冻存均不丧失其多能性。冻存 的细胞可在需要时随时解冻,继续培养不失其原有特性。 1.2 成体干细胞的生物学特征 2 干细胞在分化为特化细胞之前常产生一种或几种祖细胞，然后由祖细胞分化产生特化细胞。 与胚胎干细胞相比较，成体干细胞有以下几个特点：(1)成体干细胞体积小，细胞器稀少，RNA 含量较低，在增殖过程中处于相对静止状态，在组织结构中位置相对固定。(2)成体干细胞数量 很少，其基本功能是参与组织更新，创伤修复及维持机体内环境稳定。研究结果表明，即使在 含量丰富的骨髓中，每 10，00015，000 个骨髓细胞中只有一个造血干细胞6，人和动物 皮肤中的干细胞含量仅为 7%87。Reynolds 等8实验证明成体哺乳动物脑内的神经 干细胞数量极少，仅占室下带区中相对静止 细胞数的 0.1%1%。(3)成体干细胞常处于一个有干细胞细胞基质，对干细胞的增殖和分化起调 控作用的各种信号分子的特定微环境或称生物位（nich）中，干细胞是自我复制还是分化为功 能细胞取决于所在的微环境和自身的功能状态。(4)成体干细胞没有确定的来源。有科学家推测， 成体干细胞是胚胎发育过程中保存下来的未分化的细胞6，这揭示成体干细胞与胚胎干细胞 可能会有更多的相似性与同源性。 2 干细胞的可塑性 干细胞的可塑性主要是指成体干细胞的可塑性。人们把成体干细胞具有分化为其他类型组织 细胞的能力的这种现象称为干细胞的可塑性9，横向分化10或转决定11。1995 年， Pereira 等12证明，小鼠骨髓细胞在体外培养后具有向骨、软骨和肺基质转化的能力。1999 年,Bjornson 等13将胚胎和成年小鼠神经干细胞,以及在体外克隆的神经干细胞移植给亚致 死剂量照射的小鼠,结果证明神经干细胞可转化为造血细胞。同年 Jackson 等14用 Hoechst333422-lowSP 纯化的小鼠造血干细胞进一步证明它可迁移到肌肉损伤部位,在参与肌肉 再生的同时也参与血管的再生。2002 年 Vescovi 等15报道神经干细胞除有向神经元、星形 细胞与少突胶质细胞分化能力以外,还可分化为造血细胞谱系。 肝干细胞也是干细胞可塑性的主要可靠证据之一。2000 年 Alison 等16和 Lagasse 等 17分别报道 HSC 可在体内分化成肝细胞。2001 年 Shen 等18在骨髓移植的试验中发现, 肝脏干细胞能表达供体造血细胞的遗传标志。 这一系列的证据表明干细胞存在可塑性。然而，近几年来，部分研究学者对干细胞的可塑 性提出了不同的 看法:(1)细胞自发融合导致“可塑性”。英国科学家 2002 年,Ying 等19的研 究结果表明, 胚胎干细胞在体外与神经或 HSC 共同培养时,能自发地发生神经或 HSC 与胚胎干细 胞之间的融合,诱导 NSC 或 HSC“横向分化”为胚胎样干细胞,然后展现出胚胎干细胞的表型特征 与相应功能。同年美国科学家 Terada 等20用充分的证据证明,骨髓细胞的多向分化是因为 与胚胎干细胞融合所致,而不是骨髓细胞直接横向分化的结果。这两者的研究结果都表明，是由 于发生了细胞融合，使所谓的成年组织干细胞具有了“可塑性”潜能。(2)成体干细胞的横向分 化是成体组织中余存的胚胎原始干细胞所致。2002 年 jiang 等21的研究结果证实,在成体组 织中余存着一种数量稀少的胚胎样原始干细胞,表达胚胎干细胞的标志如 Oct-4、Rex-1 及 SSEA- 1,体外培养条件也类似于胚胎干细胞,所谓的成体组织干细胞的“可塑性”很可能是这些细胞所 为。(3)2002 年，在 Science 和 Nature 上连续刊发的几篇文章指出，成体干细胞可塑性可能是 实验设计不严谨，判断错误所致，认为所谓的成体干细胞可塑性缺乏科学依据。 3 干细胞的分离培养 3 由于干细胞的数目很少，因此需要在体外对干细胞进行非分化性增殖。干细胞的分离培养 的理论基础是其生物学特征，包括形态和结构特征及其生物学表型。 干细胞的分离培养实验主要是建立在老鼠的实验上，早在二十世纪七八十年代就已从小鼠 中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养成功。近年来，国内在这方面的研究也取得了一定的进 展，主要是在神经干细胞等成体干细胞的研究上。2002 年陈雷等22应用无血清培养技术从 胎鼠脊髓分离到的神经系统的干细胞具有不断分裂增殖的能力, 可被神经干细胞特异性抗体所 标记, 并在血清条件下分裂为神经系统多种细胞。2004 年冯玉萍等23用胰酶消化加机械吹 打分离大鼠大脑皮质及皮质下组织,之后用悬浮培养法、有限稀释法获得来源于同一细胞的亚细 胞系克隆; 2005 年肖美玲等24用同样的方法分离新生昆明种小鼠(出生 24 h 内) 的大脑组 织，利用无血清培养基悬浮培养细胞,获得具有自我增殖能力的细胞克隆,两者经用免疫细胞化 学法鉴定为神经干细胞。 虽然老鼠的干细胞体外培养实验已经取得了可喜的进展，但人的干细胞的体外培养直到 1995 年,Thomson 等从恒河猴的囊胚中分离,建立了第一个灵长类动物的胚胎干细胞株后，才获 得成功并得到迅速的发展。1998 年,Thomson1和 Gearhart2分别用胚胎干细胞和胚胎生 殖细胞建立了人的胚胎干细胞系,在体细胞与生殖细胞间架起了桥梁,为研究胚胎干细胞的发育, 在体外培养人体细胞和组织,利用 ES 细胞治疗疾病提供了广阔的发展前景。在报道分离了人的 胚胎干细胞这一重大成果后不久,美国 Advance Cell Technology (ACT, Worcester, M)的研究 者宣称,他们通过使人的皮肤细胞和牛的卵细胞杂交,培育出了人的胚胎干细胞。所用的方法与 克隆实验中采用的方法相似,基本上是对人的细胞重新编程并使其回到它最初的原始状态。该发 现可能导致许多新方法的产生,如通过移植和细胞治疗来医治疾病。2002 年李巍等25采用无 血清培养技术, 成功地分离培养了人胚胎大脑皮层神经干细胞，且能被诱导分化成神经元和神 经胶质细胞。经传 12 代后仍具干细胞特性。2004 年王共先等26以器官捐献者的正常前列腺 为研究对象,利用免疫磁珠细胞成功从前列腺基底细胞中分离前列腺干细胞。同年汪泱等27 和罗树伟等28均成功分离培养了人胚脑神经干细胞，并进行进一步的检测和研究。 4 干细胞的应用 胚胎干细胞是细胞的源头,具有多能或全能性,并能够无限分化,能够制造机体需要的全部细 胞,因此在医学和生物学上具有巨大潜力,应用前景广阔。但它存在着移植免疫排斥的限制和伦 理学方面的困扰, 而成体干细胞只能在体外有限扩增,多系分化效力低,通过体外的扩增培养虽 能够提高转化效率, 然而体外转化是否会引起干细胞遗传特性的改变尚不清楚。 但这类干细胞 存在于宿主体内,可直接从患者自身获得,故无移植免疫排斥的限制也无伦理学方面的困扰,因此 胚胎干细胞和成体干细胞的研究对生命科学领域而言,都具有极重要的意义。 4.1 为发育生物学研究提供良好的体外模型系统哺乳动物胚胎体积较小，而且在子宫内进 行发育，因此很难在动物体内连续动态地研究其早期胚胎发育、细胞组织分化及基因表达调控， 而来源于胚胎的胚胎干细胞具有发育全能性、可操作性及无限扩增的特性，因此胚胎干细胞提 供了在细胞和分子水平上研究个体发育过程中极早期事件的良好材料和方法。随着分子生物学 的发展，通过比较胚胎干细胞不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可确定胚 胎发育及细胞分化的分子机制、发现新基因。结合基因打靶技术，可发现不同基因在生命活动 中的功能等。 4 4.2 在医学上的应用理论上讲，干细胞可以用于临床细胞移植治疗各种疾病和构建人工组 织或器官，其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死、肿瘤，退行性病变 如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。应用干细胞治疗疾病较传统方法 具有很多优点：低毒性或无毒性，一次药有效；不需要完全了解疾病发病的确切机理；不存在 传播疾病的风险：还可能应用自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。 1999 年 Horwitz 等29用骨髓间充质干细胞（BMSC）治疗遗传性骨缺陷病，并取得了一 定效果。2004 年 9 月，意大利一名 5 岁、患有地中海贫血症的男孩卢卡，科学家通过从其弟弟 的胎盘血中提取干细胞移植到卢卡身上，使其战胜病魔，完全治愈。 4.3 生产克隆动物的高效材料胚胎干细胞是动物克隆的优良核供体。胚胎干细胞可以无限 传代和增殖而不失去其基因型和表现型,以其作为核供体进行核移植后在短期内可获得大量基因 型和表现型完全相同的个体。胚胎干细胞与胚胎嵌合生产克隆动物可解决哺乳动物远缘杂交的 困难问题。另外,由于体细胞克隆动物存在成功率低、早衰、易缺陷易突变等问题，且多是致命 的,使胚胎干细胞的克隆研究仍十分重要。1999 年 Wakayaama 等30用长期传代的小鼠胚胎干 细胞克隆出 31 只小鼠，14 只存活，存活率比体细胞克隆高。 4.4 高效新型药物的发现、筛选及动物和人类疾病的模型胚胎干细胞提供了新药物的药理药 效、毒理及药物代谢等研究的细胞水平的研究手段，利用胚胎干细胞体外分化的细胞组织检验 筛选新药，可大大减少药物实验所需实验动物的数量及其人群数量，胚胎干细胞还可用来研究 动物和人类疾病的发生机制和发展过程以便找到有效和持久的治疗方法。 4.5 生产转基因动物的高效载体 利用胚胎干细胞作载体使外源基因的整合筛选等工 作能在细胞水平上进行,使操作简便可靠。 5 问题与展望 近年来,随着生物细胞实验技术及分子生物学的发展,干细胞研究领域取得了突破性进展,某 些方面已有初步的临床应用。但是目前干细胞的研究尚处于初期阶段，许多理论问题亟待解决： （1）干细胞的许多机制还没完全清楚，比如在干细胞可塑性机理的研究上还存在着分歧。 如何使干细胞在体外大量扩增,并诱导其分化是干细胞在医学临床上应用的关键。 （2）干细胞如何到达不同的靶目标，并分化为正确的细胞类型及正确的细胞数量、比例 以及在正确的位置与正确的靶组织建立正确的联系而无任何错误连接等。 （3）干细胞移植的安全性问题:胚胎干细胞移植时会发生不适宜的分化,产生免疫排斥作 用，但成体干细胞则没有这个问题，其主要的机理还没完全明白，因此干细胞在临床应用前需 要进行全面的评估。 6 结束语 相信随着细胞分子生物学技术的应用,不久的将来干细胞许多相关机制将被逐渐阐明， 人 类将有可能人为地控制影响干细胞分化的各项因素， 但我们也应该清楚的认识到， 仍有许多 5 悬而未决的问题，干细胞的临床应用还有很长的路要走。干细胞用于治疗许多疑难症状在动物 实验已经取得了可喜的成就，如果经人体临床试验成功，其潜在的效益将溢现出来，造福人类。 目前，我国在干细胞研究上相对落后，国家已经重视干细胞的研究，将干细胞的研究列入 973 项目，并成立了干细胞研究所，加强干细胞的基础知识与临床应用方面的研究，这将使我国 在此领域的理论和实践应用上得到更大的发展，在世界上占有一席之地。 【参考文献】 1 Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS,et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. 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