应该采用哪些方法来诊断血液病

采用那些方法来诊断血液病 作者：童春容 介绍：陆道培血液病医院 副院长 血液科主任 奋战在血液病诊治一线 20 余年，有着丰富的临床经验，擅长血液病的整合诊断及 治疗；恶性肿瘤，尤其是急性白血病的免疫治疗。 MICM-P 诊断技术在血液病诊治中的价值 血液病是造血免疫系统发生异常的疾病，主要表现为血液细胞增多或减少，或 各类细胞功能缺陷，如粒细胞、单核细胞、红细胞或血红蛋白、淋巴细胞增多或减少， 淋巴细胞产生的免疫球蛋白减少或异常免疫球蛋白增加等。血液病的种类很多，包括 良性血液病、恶性血液病，遗传性或先天性血液病或后天获得性血液病。不同种类血 液病的表现有很大的相似性，如营养不良性贫血和恶性血液病都表现为疲乏、无力、 面色苍白等贫血现象，医生根据患者的临床表现很难做出正确的诊断，血液病的诊断 在很大程度上依赖实验室诊断技术。 正确的诊断可以指导医生制定正确的治疗方案或策略，找到监测治疗效果的指 标以帮助确定停止治疗的时机。正确的诊断可以为患者节省大量的治疗经费，甚至挽 救患者的生命；而错误的或不全面的诊断可能浪费大量的治疗经费、增加患者的痛苦， 甚至失去治愈的时机。 从 1995 年开始，世界卫生组织（WHO）成立了一个指导委员会，提出了恶性 血液及淋巴系统疾病的统一诊断与分型标准，分别于 2001 年、2004 年、2008 年修订。 WHO 提出，在患者初次就诊时，只要条件许可，应尽可能给患者进行全面的检查评估， 除了全面病史、体格检查、生化、三大常规、按病情所需进行的其它检查外，特别要 进行细胞形态学（M）、免疫学（I）、染色体（C）、疾病相关基因（M ），甚至病原 学（P ）的检测，也即 MICM-P 整合诊断技术，恶性血液及淋巴细胞系统疾病的诊断与 分型进入了 MICM-P 整合诊断与分型的时代。 MICM-P 中的技术各有优缺点，整合起来 就能较好地反应疾病的全貌，做出更全面的诊断。就像我们看大象一样，从不同方向 看可以得出不同的结论，但是把不同方向看到的结果整合起来，得到的大象图像更符 合真实大象。而一些医生仅采用细胞形态、病理检测或组织免疫化学染色来诊断恶性 血液淋巴系统疾病，容易误诊或漏诊，或丢失重要的指导治疗的指标。以下分别介绍 这些实验室诊断技术在血液病诊治中的价值。 细胞形态学检测 医生一旦发现患者的血常规有问题，常常要给患者进行血液白细胞分类、骨髓 穿刺涂片或活检组织病理检测，实验室技术人员如果发现有异常细胞难以分辨，还要 对其进行细胞化学染色，甚至在电镜下观察细胞的超微结构，这些都是属于细胞形态 检测。 细胞形态检测主要通过观察骨髓穿刺抽吸的细胞涂片、血液细胞涂片、或其它 组织细胞涂片、印片，或结合细胞化学染色来完成，是血液病诊断与分型的最基础方 法，易于在基层单位推广，很多医院都能做此种检测，大多数患者到我院来一般都会 带来血液或骨髓细胞形态的报告。根据细胞形态的观察可发现形态异常的细胞，向临 床医生提示需要进一步检测的方向，对大多数急性白血病可以提出诊断意见。但是， 细胞形态报告是由技术人员在显微镜下观察得出的结论，有比较大的主观性；技术人 员需要接受过很好的培训，有较长期的工作经验；而且即使最有经验的技术人员也会 有较多不一致的意见。以急性白血病的诊断为例，由法国、美国、英国三个国家顶级 血液细胞形态学专家组成了 FAB 白血病分型协作组，他们观察同一批患者的细胞形态 后作出的诊断仅对 60%70%的患者意见一致；急性白血病的形态学诊断与分型对预 后判断、疗效监测、指导治疗的价值也不太大。对细胞形态和正常细胞接近的慢性白 血病或其它血液病，仅观察形态学很难做出正确的诊断。 一些恶性细胞难以通过骨髓穿刺抽吸出来，如何杰金淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、 一些白血病细胞等。骨髓活检是将一块骨髓组织取出而不是抽吸出来的细胞涂片，对 活检组织进行病理检查能全面地反映骨髓中的各类细胞的分布，可了解骨髓组织是否 有纤维化、组织结构是否被破坏等。骨髓活检对于有骨髓纤维化、骨髓穿刺困难、难 以抽取的细胞尤其重要。如果患者表现为淋巴结肿大、其它器官出现包块，可以活检 组织进行病理及免疫组织化学染色分析。 我们在临床上经常碰到根据形态学报告误诊的例子，如把肺癌诊断为急性白血 病，把中枢神经系统淋巴瘤诊断为结核性脑膜炎，把特殊类型淋巴瘤诊断为急性白血 病，把髓系肉瘤诊断为淋巴瘤，把病毒感染的噬血综合征诊断为淋巴瘤等，而分型错 误更为多见，这些患者为此付出高昂的治疗经费，或险些死亡或错失治疗时机而死亡。 免疫学分析 免疫学分析主要包括免疫组织化学染色(IHC)及流式细胞分析技术(FCM)，即采 用不同染料或荧光染料标记的单克隆抗体（Mab）对细胞悬液、细胞涂片或 BM 组织切 片进行染色，细胞表面或细胞内如果有单抗检测到的抗原标记，细胞的颜色发生改变 或发出某种颜色的荧光。IHC 是在显微镜下或荧光显微镜下观测细胞颜色的变化或荧 光变化，从而了解细胞是否有某种抗原标记。FCM 是采用流式细胞仪检测细胞的抗原 标记。由于不同类型及不同成熟阶段的血液及免疫细胞表达不同的抗原，恶性细胞还 经常有抗原标记的异常，因此免疫学分析可以帮助鉴别细胞的良恶性（恶性细胞还是 良性细胞）、成熟阶段（原始细胞还是其它成熟细胞）及系列来源（中性粒细胞、嗜 酸性粒细胞、T 淋巴细胞、 B 淋巴细胞、幼红细胞、单核细胞、非血液及淋巴系统的细 胞等）。以急性白血病为例，免疫分析结合细胞形态及细胞化学染色方法，可将 90 99%的急性髓性白血病（AML）与急性淋巴细胞白血病（ ALL）区分开来，重复性可提 高至 99%；尤其是混合性白血病、未分化型白血病的诊断在很大程度上依赖免疫分型 技术。 IHC 的优点是可以在组织结构基础上观察某种抗原标记的细胞，细胞几乎不丢 失。缺点是制备标本的时间较长，每次只能观测细胞上的一个标记，耗费人力，每次 报告观测的细胞不可能太多，一般只有几百至几千个细胞。 FCM 分析技术可同时检测每个细胞上 4 个以上的抗原标记，如果将细胞分试管 染色，一次可以检测细胞的数十个标记，流式细胞细胞仪可在短时间内检测数万个至 数十万个细胞，检测敏感度高，报告快（可在 2 个小时内做出诊断）。综合很多标志 分析，FCM 更易区分细胞的良恶性，因此可监测恶性肿瘤细胞侵犯骨髓的程度，可确 立监测微小残留恶性肿瘤细胞 (MRD)的标志，并监测治疗后的 MRD；用 FCM 监测 MRD 的敏感性可达万分之一，即 1 万个细胞中有一个恶性细胞可以用 FCM 技术监测 出来，从而帮助医生了解治疗效果，更好地调整治疗方法。由于一些单克隆抗体药物 （如抗 CD20、 CD52、CD33、CD19、CD22 等的单抗）已经用于临床治疗这些抗原标 志阳性的恶性肿瘤，如美罗华（抗 CD20 单抗）治疗 CD20+的淋巴瘤或白血病疗效好， 而抗 CD33 单抗对 CD33+的白血病有效，所以免疫分型还可以帮助指导单克隆抗体为 基础的靶向治疗。一些免疫标志阳性的白血病预后不好（如 CD34+CD56+的 AML 预 后不好），因此免疫分型尚有一定的预后意义。FCM 还可以分析脑脊液、胸水、腹水 及其其它组织穿刺抽吸及活检的标本。但是一些细胞在标本运输、染色、洗涤等制备 过程中可能丢失，一些大细胞难以被 FCM 检测出来，一些恶性细胞难以用免疫分析方 法确定其良恶性，因此 FCM 也可能出现漏诊或误诊。 染色体检测 每个正常人的每个细胞经过制备后都可形成 23 对染色体，包括 1 号至 22 号染 色体及一对性染色体。一些血液病可能发生染色体异常，或染色体异常是引起一些血 液病的主要原因，而且染色体异常具有独立的预后及指导治疗的价值，因此 WHO 直 接根据染色体异常来命名一些白血病或其它血液病。 如 t（15 ；17 ）染色体异常及 t(11;17)染色体异常的急性早幼粒细胞性白血病 （APL）在形态上很相似，难以区分，都诊断为急性早幼粒细胞白血病；但 t（15 ；17 ）的 APL 用全反式维甲酸(ATRA)、砷剂及蒽环类药物治疗的疗效好，其治 愈率可达 70-96%；而 APL 用 ATRA 及砷剂治疗疗效就不太好。t（9;22 ）染色体异常 见于慢性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病（ALL ），甚至一些急性髓性白血病(AML)， 这些类型白血病的形态学及临床表现差异较大，但他们的共同特点是用洛氨酸酶抑制 剂(TKI)，如格列卫治疗疗效较好。t(8;21)染色体异常的 AML 采用大剂量阿糖胞苷治 疗疗效好，但是如果同时失去了 Y 染色体，治疗效果不好，往往需要异基因造血干细 胞移植（allo-HSCT ）治疗。有复杂染色体异常的白血病预后很差，需要尽快进行 allo- HSCT 治疗等等。染色体对淋巴瘤患者也有很好的诊断及预后价值，如套细胞淋巴瘤 (MCL)与慢性 B 细胞白血病或小 B 细胞淋巴瘤(B-CLL/SLL)的形态学及免疫学标记很接 近，但前者的进展明显比后者差，因此鉴别两者有重要的价值，大多数 MCL 有 t(11;14)染色体异常，故该染色体异常有诊断价值。一些有复杂染色体异常的淋巴母细 胞淋巴瘤预后很差，需要 allo-HSCT 治疗。很多治疗可以引起新的染色体异常，治疗 后定期检测染色体，可以发现新的染色体异常等。但是目前很多医生尤其忽视淋巴瘤 的染色体检查，因此需要提请大家重视染色体检测。但是一些恶性细胞不分裂，难以 形成染色体供分析，因此染色体异常的比例不能真正反映恶性细胞的比例；染色体的 制备与分析耗时长，报告时间长，难以指导第一次治疗方案；染色体分析需要经验丰 富的技术人员，报告有一定的主观性；而且染色体检测只能检测 1%以上的恶性细胞， 因此不能用于检测 MRD。 荧光标记不同染色体或基因片段探针的原位杂交技术（FISH）可以检测很微小 的染色体异常，可以检测不分裂的细胞，分析的细胞数目明显比染色体核型分析多， 因此大大增加了染色体分析的敏感性和准确性。但是 FISH 技术使用的探针较昂贵，一 次只能检测一种或数种异常，同时检测 23 对染色体的探针目前还很难常规用于临床诊 断。因此目前 FISH 主要用一些常见的异常染色体组合探针来诊断常见的染色体异常， FISH 更多用于监测治疗后的 MRD，其敏感性可达千分之一。 血液病相关基因的检测 随着分子生物学技术的发展，发现越来越多的基因异常与血液病相关。目前已 发现数百种基因与白血病有关，多重巢氏 PCR 及基因芯片技术可快速检测数百种白血 病基因，这些基因可以帮助白血病的分型、判断预后、指导治疗，监测 MRD。如 t(15;17)染色体异常可以产生 PML-RARA 融合基因，t(9;22)染色体异常可以产生 BCR- ABL 融合基因，t(8;21)异常可以产生 AML1-ETO 融合基因；有时候检测不出染色体异 常，但检测得出这些白血病基因，其临床意义与染色体异常的价值相近，如有 BCR- ABL 融合基因的白血病但染色体正常的白血病与 t(9;22)异常地白血病一样用格列卫治 疗效果好等等。一些基因异常对一些血液病的诊断和治疗具有决定性价值，如 98%的 真性红细胞增多症有 JAK2 基因突变，检测出 JAK2 基因突变可以提前诊断改病。肥大 细胞增多症患者如果检测出 KITD816V 基因突变可以诊断为恶性肥大细胞病。嗜酸细 胞增多症的患者如果检测出 FIP1L1-PDGFRa 或 基因异常可诊断为恶性嗜酸性细胞增 多症，用小剂量格列卫治疗即有效。我们采用每周 1 粒格列卫治疗了 2 例 FIP1L1- PDGFRa 嗜酸细胞增多症，疗效非常好，患者长期生存至今。而同样表现为嗜酸细胞 增多的慢性嗜酸细胞白血病疗效很差，即使采用 allo-HSCT 治疗效果也不好。一些噬 血综合征为免疫相关基因突变引起，临床疗效很差，必须采用 allo-HSCT 治疗，及时 检测这些突变基因可提前作出治疗方案，避免长期的治疗和经费。定量检测恶性疾病 基因监测 MRD 的敏感性可达十万分之一甚至百万分之一，是目前监测 MRD 最敏感的 指标。 病原学检测 越来越多的研究发现，病原感染与某些类型的血液病有关，如成人 T 淋巴细胞 白血病病毒(HTLV) 与成人 T 细胞白血病/淋巴瘤（ATLL ）有关，EB 病毒(EBV)与淋巴系 统白血病或淋巴瘤有关，丙型肝炎病毒、幽门螺旋杆菌、人类疱疹病毒(HHV)与某些类 型的淋巴瘤有关。一些病原感染如微小病毒 B19、巨细胞病毒、腺病毒、其它多种疱 疹病毒等病毒感染与多种血液病有关，如再生