探究口腔分泌性白细胞蛋白酶对艾滋病毒的抑制作用

探究口腔分泌性白细胞蛋白酶对艾滋病毒的抑制作用 96k2b 骆媛 107230 立题依据： 1.上世纪八九十年代，流行病学分析发现艾滋病通过口腔唾液传播的几率是极低的，或者 说基本没有。虽然研究人员可以在艾滋病人的唾液里检测到艾滋病毒的基因，但从那里分 离出来的病毒却没办法去感染别的细胞。这个现象引出一个大胆猜想：口腔里一定含有一 些抗艾滋病毒的成分！ 2.近期，美国科学家发现，人的唾液中有一种“分泌性白细胞抑制蛋白酶”的蛋白质，这种 蛋白在试管中可以有效抑制艾滋病病毒感染人体免疫细胞 3.南京大学校医学院吴稚伟教授在美国纽约大学工作时，开始从事分离人体口腔下腭唾液 的研究，经过对唾液成分的研究发现：唾液里含有若干种能抗 HIV 感染的活性蛋白，特别 是一种称之为 GP340 的蛋白质，能清除口腔里的某些细菌，对保护牙齿有重要作用。 实验目的： 通过对照实验观察样品中 HIV 抗原抗体水平的改变验证分泌性白细胞蛋白酶对 HIV 的抑制 作用 实验原理： 1.ELISA 是应用酶标记的抗体（或抗原）在固相支持物表面检测未知抗原（或抗体）的方法。 酶与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物后颜色反应来判定是否有免疫反应的存在， 颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比，借助分光光度计的光吸收计算抗体 (抗原)的量。 2. 采用夹心 ELISA 方法检测血清或血浆标本中人类免疫缺陷病毒 HIV（1+2）型抗体，预包 被高纯度基因重组 HIV（1+2 ）型抗原，可与标本中的抗-HIV 抗体反应，加入 HRP 标记 HIV（1+2）型抗体抗原结合，形成抗原抗体酶标抗原复合物，然后加入 TMB 底物产生 显色反应。通过酶标仪检测吸光度（OD 值） ，根据 OD 值判断 HIV 抗体的存在与否。 3.双抗原夹心法检测抗体 . 4.HIV 的特性和感染途径 1）基本结构 2）生活周期：吸附- 穿入-脱壳-生物合成- 组装成熟和释放 HIV-1 通过 gp120 与靶细胞表面 CD4 分子和趋化因子受体结合 3）感染后的血清学改变 实验方法： 试剂与器材： 1.微量加样器、洗板机、温箱、冰箱等 2.第四代艾滋病酶联免疫试剂 （solid phase: 病毒裂解液;重组抗原合成肽;HIV-1 / -2 / -O;anti-p24 Ab Conjugate: 病毒裂解液 ;重组抗原合成肽;HIV-1 / -2 / -O;anti-p24 Ab Specific detection of: IgM / IgG 抗体;HIV-1 / -2 / -O;p24 抗原 Method:夹心） 3. HIV 检测试剂盒，包括 HIV 酶标板；HIV 酶标试剂； HIV（1+2）型阳性及阴性对照 血清；显色剂 A 液和 B 液； 浓缩洗涤液、终止液、自封袋、封板膜等 4.口腔分泌性白细胞蛋白酶抑制物提取液 5.感染 HIV 的血清（ A 样本） 6.用口腔分泌性白细胞蛋白酶抑制物提取液干预培养的感染 HIV 血清（B 样本） 操作步骤： 1. 设实验组和对照组两条酶标版 2. 配液：将 50ml 浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水 25 倍稀释至 1000ml 备用。 3. 编号：实验组和对照组都将样品对应微孔按序编号，每板设阴性对照 2 孔、 阳性对照 3 孔，空白对照 2 孔。 4. 加样：对照组分别在相应孔加入待检标本 A、阴性、阳性对照 100l，实验 组分别在相应孔加入待检标本 B、阴性、阳性对照 100l，用封板膜封板后 置 37温育 60min 5. 洗涤：小心把封板膜揭去，用洗板机选择 5 次程序，洗板后在干净纱布上拍 干。 6. 显色：每孔加入底物缓冲液 50l，TMB 50 l，轻轻振荡混匀，封板后置 37避光显色 10min。 7. 测定：每孔加终止液 50l，轻轻振荡混匀。设定酶标仪波长为 450nm（建 议使用双波长的酶标仪比色，参考波长 630 nm） ，空白调零，读取各孔 OD 值。 8. 观察结果：比较两组的 OD 值 预期结果： 实验组的 OD 值小于对照组的 OD 值，推测实验组的 HIV 感染活性受到一定程度的抑制 参考文献： 1.分泌性白细胞蛋白酶抑制剂研究进展 （潘其重 河北医药 ） 2.分泌性白细胞蛋白酶抑制因子研究进展 （中科医学网） 3.HIV 检测技术 （湖北省十堰市太和医院检验部 胡秀学） 4.医学免疫免疫学 （吕昌龙