控制菌(大肠埃希菌)检查操作规程

控制菌（大肠埃希菌）检查操作规程 1. 目的 建立一个控制菌大肠埃希菌控制菌大肠埃希菌检查标准工作程序，规范 QC 控制菌大 肠埃希菌检查人员的控制菌大肠埃希菌检查的操作。 2. 范围 适用于本公司的口服制剂完成内包后外包前的中间体和局部给药制剂产品的内包装材 料的控制菌大肠埃希菌的检测。 3. 责任者 QC 控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部 4. 内容 4.1 检测准备 4.1.1 QC 人员接到控制菌大肠埃希菌检查的工作进程计划单 后，核对取样指令 ，确定控制菌大肠埃希菌检查所需容器具、试液、培养基等项目和数量，执行微生物 检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行控制菌大肠埃希菌检查前的准备 工作。 4.1.2 为了保证被检品在取样后规定的时间内完成检验，取样前应准备好检验需要的各 种器皿（清洗干燥包裹）、培养基和稀释剂等（配制分装包裹），并灭菌备 用。 4.2 供试液的制备 4.2.1 供试液 供试液是指按照供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法将供 试品制成供试验用的均匀液体。 文件类型 操作规程（SOP） 文件编号 编 制 人 编制日期 年 月 日 编制部门 审 核 人 审核日期 年 月 日 审核部门 批 准 人 批准日期 年 月 日 颁发部门 编订依据 中国药典2010 年版、GMP2010 年版 替代文件 4.2.2 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物需特性，采取适宜的方法制备供试 液。如果使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微 生物的生长和存活无影响性。 4.2.2.1 可溶性液体供试品 第 3 页/共 9 页 取供试品 10ml，加 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml，混匀，作为供试液。可 溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。 4.2.2.2 非水溶性液体供试品 油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯 80 使供试品分散均匀，然后再加 0.9%无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液至 100m，混匀，作为供试液。 4.2.2.3 水溶性固体、半固体或黏稠性供试品 称取供试品 10g，置 PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml 中，用匀浆仪或其他适 宜方法，混匀，作为 1：10 供试液。必要时可加适量的无菌聚山梨酯 80，并置水浴中 适当加温使供试品分散均匀。 4.2.2.4 非水溶性供试品 取供试品 5g(5m1)，加入含溶化的（温度不超过 45）5g 司盘 80、3g 单硬脂酸甘油酯、 10g 聚山梨酯 80 无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入 45pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml，边加边搅拌，使其充分乳化，作为 1:20 供试液。 4.2.2.5 肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品 10 g，加 PH6.8 无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或 PH7.6 无菌磷酸盐缓 冲液（用于结肠溶制剂）至 100ml，置 45水浴中，振摇，使溶解，作为 1:10 的供试 液。 4.2.2.7 具抑菌成分供试品 当供试品抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查，一般使用培养基稀 释法，取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少， 至不含抑菌作用。取低稀释级供试液（原液或 1:10 的供试液）2 份，每份各 1ml，分 别注入 5 个或 5 个以上平皿中（每皿 0.2ml 或0.2ml），每个平皿倾注培养基约 15ml，混匀，凝固后，倒置培养，按每 1ml 分注的平皿点计菌落数之和计数，即为每 1ml 的菌落数，共得 2 组数据，再以 2 组数的平均数乘以稀释倍数的值报告菌数。 4.2.2.8 供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过 45，时间为 30min。 文件名称 控制菌大肠埃希菌检查操作规程 文件类型 操作规程（SOP） 文件编号 编订依据 中国药典2010 年版、GMP2010 年版 替代文件 4.3 检验操作 4.3.1 操作程序 供试品 供试液 BL 增菌培养 液 MUG 蛋白胨 供试品 EMB 或麦康凯琼脂 平板 疑似菌落纯培养 361 报告 报告 1824hr MUG 阳性、Indole 阳 性 MUG 阴性、Indole 阳 性MUG 阳性、Indole 阴 性MUG 阴性、Indole 阴 性 革兰氏染色、镜检 IMViC 试验 361 361 1824hr 1824hr 1824hr361 4.3.2 培养基选择与标记 4.3.2.1 增菌培养使用胆盐乳糖（BL）培养基，标记符号为 BL 4.3.2.2 快速生化试验使用 4-甲基伞形酮葡萄苷酸蛋白胨培养基，标记符号为 MUG 4.3.2.3 分离培养使用曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）或麦康凯琼脂培养基（MacC） 4.3.2.4 纯培养使用营养琼脂（YY）培养基，标记符号为 YY 文件名称 控制菌大肠埃希菌检查操作规程 文件类型 操作规程（SOP） 文件编号 编订依据 中国药典2010 年版、GMP2010 年版 替代文件 第 5 页/共 9 页 4.3.2.5 乳糖发酵试验使用乳糖（RT）培养基、5%乳糖培养基，标记符号为 RT 4.3.2.6 靛基质试验（I）使用蛋白胨水培养基，标记符号为 RT 标记符号为 I 4.3.2.7 甲基红试验（M）使用磷酸盐葡萄糖胨水培养基，标记符号为 M 4.3.2.8 乙酰甲基甲醇生产试验（V-P）使用磷酸盐葡萄糖胨水培养基，标记符号为 V- P 4.3.2.9 枸橼酸盐利用试验（C）使用枸橼酸盐培养基，标记符号为 C 4.3.3 阳性对照与阴性对照 4.3.3.1 阳性对照试验 对各供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验，加菌量为 10100cfu，培养、检查等方法按照供试品的各控制菌检查同法进行，阳性对照试验应 检出相应的控制菌；已做验证试验的供试品，在该供试品检查时可不必再做阳性对照。 4.3.3.2 阴性对照试验 取稀释剂 10ml 加入 100ml（或 200ml）相应控制菌检查用的相 应培养基中，培养，应无菌生长。 4.3.4 增菌培养 取胆盐乳糖（BL）培养基 2 份，每份各 100ml。一份加入 10ml 供试液（相当于供试品 1g 或 1ml），另一份加入与供试液等量的稀释剂作为阴性对照。温度 36，培养 824hr，必要时可延至 48hr。阴性对照应无菌生长。 4.3.5 快速生化试验 4.3.5.1 取上述培养物 0.2ml，接种至含 5mlMUG 培养基的试管内，温度 36培养，于 5hr 和 24hr 时在 366nm 紫外灯光下观察，同时用未接种的 MUG 培养基作为本底对照。 在紫外光下若管内培养物呈蓝白色荧光，则为 MUG 阳性；不呈现荧光，则为 MUG 阴性。 4.3.5.2 观察后，沿着培养管的管壁加入数滴靛基质试液，若液面呈玫瑰红色，则为 靛基质阳性；若呈试剂本色，则为靛基质阴性。本底对照的 MUG 和靛基质试验应为阴 控制菌大肠埃希菌检查操作规程 文件类型 操作规程（SOP） 文件编号 编订依据 中国药典2010 年版、GMP2010 年版 替代文件 性。4.3.5.3 如果 MUG 阳性、靛基质阳性，则判供试品检出大肠埃希菌；如果 MUG 阴 性、靛基质阴性，则判供试品未检出大肠埃希菌。 4.3.6 分离培养 第 7 页/共 9 页 4.3.6.1 如果呈现 MUG 阳性、靛基质阴性或者 MUG 阴性、靛基质阳性时，则应将上述供 试品 BL 增菌培养液轻轻摇动，以接种环蘸取 12 环培养液划线于 EMB 或 MacC 平板上， 温度 36培养 1824hr。 4.3.6.2 观察平板，若 EMB 或 MacC 平板上无菌落生长或生长的菌落与大肠埃希菌菌落 形态特征不符，则判供试品未检出大肠埃希菌。 4.3.6.3 观察平板，当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，若 EMB 或 MacC 平板上生长 的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征相符或疑似时，应挑取可疑菌落 23 个以上菌落分 别进行分离、纯化、染色镜检和 IMViC 试验，确认大肠埃希菌。 4.3.6.4 大肠埃希菌菌落形态特征 培养基 菌落形态 EMB 呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心， 圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽 MacC 鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形、扁平，边缘整齐，表面光 滑，湿润 4.3.7 纯培养 4.3.7.1 如果 EMB 或 MacC 平板上生长的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征相符或疑似时， 以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，蘸取培养物，应挑选 23 个以上疑似菌 落，分别接种营养琼脂斜面，温度 36培养 1824hr，进行以下检查。 4.3.7.2 如果平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（如呈紫黑色或有金属光泽）， 则应蘸取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液分区划线接种于 EMB 或 MacC 平板， 温度 36培养 1824hr，再挑选单个疑似菌落，纯培养，进行以下检查。 4.3.8 革兰氏染色、镜检 4.3.8.1 以接种环蘸取无菌水于洁净无划痕的载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂 斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰 23 次固定。 控制菌大肠埃希菌检查操作规程 文件类型 操作规程（SOP） 文件编号 编订依据 中国药典2010 年版、GMP2010 年版 替代文件 4.3.8.2 在载玻片的菌斑上滴加结晶紫染液，染色 1min，水洗。 4.3.8.3 滴加碘液，媒染 1min，水洗，以滤纸吸干余水。 4.3.8.4 滴加 95%乙醇，严格控制时间脱色 2030s，水洗。 4.3.8.5 滴加沙黄染液，复染 1min，待干后，镜检。 4.3.8.6 镜检结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色；大肠埃希菌为革 兰氏阴性短杆菌或球杆菌。 4.3.9 生化（IMViC）试验 4.3.9.1 乳糖发酵试验 取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，温度 36培养 2448hr，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色，指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色）， 产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）。为了避免迟缓发酵产生假阴性，也可接种 5%乳 糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于 24hr 出现阳性，或适当延长培养时间。 4.3.9.2 靛基质试验（I） 取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，温度 36 培养 2448hr，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性， 呈试剂本色为阴性。98%的大肠埃希菌靛基质试验为阳性，一般 24Hr 即可出现阳性结 果，以无菌操作先从管中取出 1ml 或 2ml 培养液进行检查，如靛基质阴性，余下的蛋 白胨水培养物再培养 24hr，做靛基质试验。 4.3.9.3 甲基红试验（M） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中， 温度 36培养 482hr，于培养液中加入甲基红指示液 23 滴（约每 1ml 培养液 1 滴）， 轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。 4.3.9.4 乙酰甲基甲醇生产试验（V-P） 取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨 水培养基中，温度 36培养 482hr，于 2ml 培养液中加入 -萘酚乙醇试液 1ml，混匀， 再加 40%氢氧化钾试液 0.4ml，充分振摇，在 4hr（通常在 30min 时）内出现红色判为 阳性，无红色判为阴性。 控制菌大肠埃希菌检查操作规程 文件类型 操作规程（SOP） 文件编号 编订依据 中国药典2010 年版、GMP2010 年版 替代文件 聚协昌（北京）药业有限公司 GMP 文件 第 9 页/ 共 9 页 4.3.9.5 枸橼酸盐利用试验（C） 取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上， 温度 36培养 24 天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时，判为阳性， 培养基颜色无变化、无菌苔生长，判为阴性。 4.4 结果判定 4.4.1 当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验 MUG 呈阳性、靛基质阳性，供试品 MUG 阳性、靛基质阳性，报告 1g 或 1ml 供试品检出大肠埃希菌；供试品 MUG 阴性、靛基质 阴性，报告 1g 或 1ml 供试品未检出大肠埃希菌。 4.4.2 当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验 MUG 呈阳性、靛基质阳性，供试品 MUG 阳 性、靛基质阴性、IMViC 试验为“- + - -”、革兰氏阴性杆菌，报告 1g 或 1ml 供试品 检出大肠埃希菌；供试品 MUG 阴性、靛基质阳性、IMViC 试验为“+ + - -”、革兰氏 阴性杆菌，报告 1g 或 1ml 供试品检出大肠埃希菌。 4