甜菜碱选择性开放钙离子通道升高小鼠脾淋巴细胞内钙浓度研究

甜菜碱选择性开放钙离子通道升高小鼠 脾淋巴细胞内钙浓度研究 1 季宇彬 1,2，冯小燕1,2，高世勇1,2 1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心药物研究所博士后科研工作站，哈尔滨 150076； 2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨 150076） 摘要摘要：研究甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞内钙离子浓度的变化及相关钙通道的研究。 应用激光共聚焦显微镜(LSCM)测小鼠脾淋巴细胞内钙浓度的变化，应用不同钙 通道阻滞剂研究甜菜碱影响细胞内钙浓度变化途径。对终浓度 4mM 甜菜碱作 用淋巴细胞不同时间的细胞内钙离子浓度值分析表明：甜菜碱可以使淋巴细胞 内 Ca2浓度升高，6h 后效果最明显；对加入不同阻滞剂细胞内钙离子浓度变 化分析表明：钙通道及蛋白阻滞剂硝苯地平、地尔硫卓、咪贝地尔、金雀异黄 素对甜菜碱升高淋巴细胞内钙离子浓度没有影响；维拉帕米、新霉素、肝素、 普鲁卡因能阻断甜菜碱对淋巴细胞内钙离子浓度的升高作用。由此可知：细胞 内钙离子浓度升高主要通过以下途径：（1）在 G 蛋白介导下通过影响 L-型电 压门控钙通道的 1亚单位而引起外钙内流；（2）通过影响胞内钙库的 IP3R 钙 通道和 RyR 钙通道而引起内钙外排。其共同引起胞质钙离子浓度增加。 关键词：关键词：甜菜碱；细胞内 Ca2；钙通道阻滞剂 The Investigation of Calcium Channel of Betaine on Mouse Splen-lymphocytes proliferation in Vitro JI yu-bin1,2, FENG xiao-yan1,2, GAO shi-yong1,2 (1. Center of Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin University of Commerce. Harbin 150076, China. 2. Engineering Research Center of Natural Anticancer Drugs, Ministry of Education. Harbin 150076, China) Abstract: Objective To investigate the effects of Betaine on splen-lymphocytes intracellular Ca2 concentration and correlated calcium channel in vitro. To observe the 基金项目：国家自然科学基金项目（30400352） ；教育部重点项目（205045） ；黑龙江省自然科学基金 （D200611） ；黑龙江省研究生创新基金（YJSCX2006-0077HSD） 作者简介：季宇彬(1956-)，男，教授，博士生导师，研究方向为肿瘤药理学的研究。 effects of the Betaine on the Ca2i by LSCM, the path of Ca2 entering into cell with different Ca2 channel blocker. Analyzing the intracellular Ca2i, betaine can increasing the intracellular Ca2i, and the best times is 6h; Analyzing the intracellular Ca2i with Ca2+ channel blocker, the result is Nifedipine、 Diltiazem、 Mibefradil、 Genistein can not affect the role of betaine increasing lymphocytes intracellular Ca2i and Verapamil、Heparin、Neomyci- sulfate、Procaine can block the role of betaine increasing lymphocytes intracellular Ca2i. Betaine can increasing intracellular Ca2i. and the way of increasing intracellular Ca2i as following:(1)It can influence the 1-subunit of L-VDC which is affected with G-protein. (2)It can increasing intracellular Ca2i through influencing IP3R Ca2 channel and RyR Ca2 channel. Key words: Betaine；intracellular Ca2；Ca2+ channel blocker 甜菜碱是一种季氨型生物碱，又名甘氨酸甜菜碱、三甲基甘氨酸等，化学 名称为N-N-N-三甲基甘氨酸内盐，其化学结构与氨基酸、胆碱相似。甜菜碱本 身是动物体内的代谢中间产物，经大量试验证明，甜菜碱及其盐类无毒、无害、 无污染1，其小鼠半数致死量（LD50）在11000mg/kg，对动物无致畸、致癌、 致突变作用，是公认的安全物质2，且能促进脂肪代谢，促进蛋白质的合成3。 免疫是高等生物体识别自身物质和非自身物质的能力，可以保护机体4。免疫 系统由免疫器官，免疫细胞和免疫分子组成。淋巴细胞（lymphocyte）是免疫 系统中较重要的细胞，在免疫应答中起关键作用5，有关报道指出甜菜碱有增 强机体免疫的作用。T淋巴细胞激活的途径有多种，其早期变化的重要现象之 一就是细胞内游离钙离子浓度的增加6。同样B细胞活化所发生的早期变化之一 也是细胞内游离钙离子浓度的升高7。因此，测定甜菜碱作用下淋巴细胞内Ca2+ 浓度的变化对研究甜菜碱免疫调节作用的机制具有十分重要的意义。本文主要 从Ca2+通路研究甜菜碱对淋巴细胞内钙离子的影响。 1 试验材料 1.1 实验仪器 CO2培养箱（日本三洋公司） ；激光共聚焦显微镜（德国 Leica 公司） ； Olympus IX70 倒置显微镜（Olympus 公司） ；电子天平（Ohaus 公司） ；Bio-680 型酶标仪（美国 Bio-Rad 公司） ；Gilson 移液器（France） 1.3 实验药品与主要试剂 甜菜碱（浙江绿成生物技术有限公司） ；ConA（美国 Sigma 公司） ；胎牛血 清（Hyclone 公司） ；RPMI-1640（GIBCO 公司） ； Fluo-3/AM（Sigma 公司） ； 硝苯地平（Nifedipine） （Sigma 公司） ；地尔硫卓（Diltiazem） （Sigma 公司） ； 维拉帕米（Verapamil） （Sigma 公司） ；咪贝地尔（Mibefradil） （Sigma 公司） ； 金雀异黄素（Genistein） （Sigma 公司） ；肝素(Heparin)（Sigma-Aldrich 公司）； 新霉素（Neomyci-sulfate） （Sigma-Aldrich 公司）；普鲁卡因（Procaine） （Sigma 公司） ；皂素（Saponin） （Fluka 公司） 。 1.3 实验动物 BALB/c 小鼠：兼用，体重(202.0)，由中国农业科学院哈尔滨兽医 研究所提供， 2 试验方法 2.1 甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞内 Ca2浓度的影响 以颈椎脱臼法处死小鼠, 用 75乙醇浸泡小鼠 15min，沿腹腔中线剪开小 鼠胸腔，取出脾脏置于培养皿中，剪去脂肪和筋膜组织，用 RPMI1640 培养液 漂洗，用注射器芯轻轻挤压，用 200 目尼龙网过滤到玻璃离心管中，无菌 PBS，1500 rpm 离心 5 min 洗涤细胞两次，加入 0.83的氯化胺到洗过的细胞 中，静置 5min,以除去血红细胞，用 RPMI1640 培养液离心洗涤细胞两次，以除 去剩余的氯化胺，将上述收集到的脾脏细胞置于玻璃培养瓶中，在 37，5% CO2培养箱中静止培养 24h，以除去贴壁细胞，收集未贴壁的细胞悬液即获得 脾淋巴细胞。计数接种培养，台盼蓝染色计数，活细胞数大于 95。 取小鼠脾淋巴细胞，调整细胞浓度为 1.5107个mL，以 1ml/孔接种于 24 孔培养板上，加入甜菜碱使其终浓度为 4mM，设 RPMI-1640 培养基为阴性对 照组。于 0h、2h、6h、12h、18h 收集细胞。Fluo-3/AM 荧光标记：用无钙台氏 液离心洗涤两遍，用 1 倍体积的 610-3mM 的 Fluo-3/AM 与细胞悬液混合，细 胞与此混合物 37下孵育 30min。激光共聚焦扫描显微镜检测，将标记后的细 胞用激光共聚焦扫描显微镜对其进行扫描观察，用 488nm 波长的激光作为激发 波长，515nm 处探测荧光发射，用 Leica confocal software lite version 软件对扫 描图像进行分析。每组均重复三次 2.2 小鼠脾淋巴细胞相关通道及蛋白抑制剂对甜菜碱升高细胞内 Ca2+浓度的影响 取小鼠脾淋巴细胞，方法同上。调整细胞浓度为 1.5107个mL，以 1ml/ 孔接种于 24 孔培养板上。共分两大组，第一组(RPMI-1640 组)：各孔分别加入 钙通道阻滞剂：硝苯地平（Nifedipine） 、地尔硫卓（Diltiazem） 、维拉帕米 （Verapamil） 、咪贝地尔（Mibefradil） 、金雀异黄素（Genistein） 、肝素(Heparin)、 新霉素（Neomyci-sulfate） 、普鲁卡因（Procaine）及阴性对照 RPMI-1640 各 0.5ml，在 37oC 条件下孵育 20 分钟后，加入 RPMI-1640（1ml/孔） ，使各阻 滞剂终浓度分别为 210-3mM、110-3mM、510-3mM、210-3mM、510- 3mM、110-3mM、110-3mM、0.5mM；第二组（甜菜碱组）：各孔分别加入 硝苯地平、地尔硫卓、维拉帕米、咪贝地尔、金雀异黄素、新霉素、肝素、普 鲁卡因及对照组 RPMI-1640 在 37oC 条件下孵育 20 分钟后，加入甜菜碱使其 终浓度为 4mM，此时各阻断剂终浓度与第一组相同。培养 6h 后收集细胞，用 Fluo-3/AM 荧光标记，用激光共聚焦对其进行扫描，方法同上。每组均重复三 次。 其中硝苯地平、地尔硫卓、维拉帕米是细胞膜 L-型电压门控钙通道阻断剂， 它们分别与 L-型钙通道的三个独立位点相结合，具有药理学配体和受体结合的 特性；咪贝地尔是细胞膜 T-型电压门控钙通道阻断剂；金雀异黄素是酪氨酸蛋 白激酶抑制剂，可抑制激酶的磷酸化位点，抑制包括自身磷酸化在内的磷酸化； 肝素是三磷酸肌醇受体拮抗剂；新霉素是磷脂酶 C（PLC）的抑制剂，它可阻 断由 PLC 催化的磷脂肌醇代谢，从而抑制 IP3的生成；普鲁卡因是胞内内质网 ryanodine 受体钙通道的阻断剂。 2.4 统计分析 用 SPSS13.0 软件对实验数据进行方差分析。 3 实验结果 3.1 甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞内 Ca2浓度的影响 加入甜菜碱不用时间后，淋巴细胞内 Ca2浓度与同期对照组相比显著升高。 其中加药 6h 后最高，12h 后有所下降。（见（见 Table1，Fig1） Table1 Influence of Betaine on intracellular Ca2+i of mouse splen-lymphocytes（ ，n=20） x TimeControlBetaine 2h 6h 12h 18h 31.804.09 32.639.11 31.653.48 32.432.40 34.097.63 46.847.88* 37.914.63* 37.764.44* *p0.05 vs control , *p0.01 vs control 3.2 小鼠脾淋巴细胞相关通道及蛋白抑制剂对细胞内 Ca2+浓度的影响 RPMI 1640 组加入阻断剂后钙离子浓度与其相应的空白对照相比均无变化， 说明各通道蛋白阻滞剂对小鼠脾淋巴细胞本身钙离子浓度没有影响。甜菜碱组 加入不同阻断剂后钙离子浓度与其相应的空白对照比较，其中硝苯地平、地尔 硫卓、咪贝地尔、金雀异黄素对甜菜碱诱导的淋巴细胞内钙离子浓度没有影响， 而维拉帕米、肝素、新霉素、普鲁卡因能显著抑制甜菜碱诱导的淋巴细胞内钙 离子升高的作用。相同条件下，甜菜碱组的空白对照与 RPMI 1640 组的空白对 照相比有显著性差异，与前面所做的甜菜碱能升高淋巴细胞内钙离子浓度的实 验结果相符，说明该实验可行。( (见见 Table2) ) Table2 Influence of correlated path and proteo-inhibitor on Ca2+ of mouse splen-lymphocytes（ ，n=20） x blockersRPMI 1640Betaine Control Nifedipine Diltiazem Verapamil Mibefradil Genistein Heparin Neomycin sulfate Procaine 32.026.33 32.204.76 32.013.88 30.943.98 31.833.00 30.973.76 32.054.16 31.684.92 31.833.87 46.517.68 46.618.87 46.709.29 31.315.07* 43.748.05 42.954.39 30.645.03* 32.504.38* 31.575.03* *p0.05, *p0.01 vs Betaine control p0.05, p0.01 vs RPMI1640 control 4 讨论 细胞内 Ca2+浓度的升高，是淋巴细胞激活和增殖中早期呈现的一个重要现 象。细胞内游离 Ca2 +浓度的改变是细胞生理功能的重要物质基础,也是多种受体 激动后信号传递过程中的中心环节8。本文用激光共聚焦显微镜扫描，观察到 不同时间的淋巴细胞内 Ca2浓度都明显高于同期的对照组，表明 Ca2在加甜 菜碱 2h 后就对淋巴细胞增殖进行调控，且 6h 后达到最大值，之后 Ca2浓度反 而下降，可能原因是淋巴细胞处于分裂、增殖状态，这就使细胞所处的生长周 期不同，所表达的钙通道数量不同，细胞内 Ca2浓度增加程度也就不同。 钙离子作为细胞信使的基础，调控着细胞的生理作用9。细胞内钙离子浓 度的变化受钙离子通道的影响，目前已知的钙通道种类较多，主要分为：电压 门控钙通道（VDC）、受体操控性钙通道（ROC）、机械操纵性钙通道和钙库 调控性钙通道（SOC）。电压门控钙通道主要受控于膜电压的变化，但也能被 神经递质、G 蛋白、信使依赖激酶所调控，主要存在于可兴奋性细胞10。电压 门控通道又分为四种：L、T、N 和 P 型。L 型和 T 型广泛存在于各种细胞，N 和 P 型存在于神经细胞。细胞中的内质网有很强的 Ca2摄入能力，所以普遍认 为是胞内主要钙库。L 型钙通道是镶钳在细胞膜双脂质层中的糖蛋白复合体， 是一种 multimeric 蛋白质，主要由 1、2 3 个亚单位组成， 亚单位附着 于 2亚单位上，其中 1是 L 型钙通道的主要功能亚单位， 和 2 为辅助性亚 单位。至今发现的 L 型钙通道拮抗剂至少有 3 类：(1) 双氢吡啶类，如硝苯地 平；(2) 苯噻氮卓类，如地尔硫卓；(3) 苯烷胺类，如维拉帕米。L 型钙通道三 种阻断剂的化学结构不同，与钙通道结合的位点也不同，其中已明确表明维拉 帕米是 1亚单位的阻断剂。我们的实验发现，硝苯地平和地尔硫卓对甜菜碱升 高淋巴细胞内钙离子浓度没有影响，而维拉帕米能抑制甜菜碱引起的细胞内钙 升高。可知，甜菜碱使细胞内钙离子浓度增加与影响 L 型钙通道的 1亚单位有 关。而咪贝地尔是细胞膜 T-型电压门控钙通道阻断剂，其对甜菜碱诱导的淋巴 细胞内钙离子浓度的升高没有影响，说明甜菜碱升高细胞内钙离子浓度不是通 过激活 T-型电压门控钙通道。金雀异黄素是酪氨酸蛋白激酶抑制剂，而新霉素 是磷脂酶 C（PLC）的抑制剂11。金雀异黄素对甜菜碱诱导的淋巴细胞内钙离 子浓度的升高没有影响，而新霉素能抑制甜菜碱诱导的细胞内钙升高。说明细 胞内钙离子浓度的升高是通过 G 蛋白- PLC- IP3这条途径，而不是通过激活酪 氨酸蛋白激酶而起作用。由此可知：甜菜碱升高细胞内钙离子浓度的途径之一 是在 G 蛋白介导下通过影响 L 型钙通道的 1亚单位引起外钙内流。 淋巴细胞内主要的钙库是内质网(ER)， Ca2+通道通过不同的调节机制将 ER 内的钙离子释放到细胞浆内以发挥相应的生物效应。内质网钙通道主要有两 种：内质网膜 IP3受体（IP3R）钙通道和 ryanodine 受体（RyR）钙通道，广泛 存在于大多数细胞中。肝素是胞内内质网 IP3R 钙通道阻断剂，普鲁卡因是 RyR 钙通道阻断剂，其均能抑制细胞内甜菜碱诱导的钙离子升高。说明甜菜碱 升高淋巴细胞内钙离子浓度的途径之二是通过影响细胞内 IP3R 钙通道和 RyR 钙通道，其共同作用引起胞质钙增加。肝素为水溶性物质，不易被动扩散进入 细胞，实验时需先对细胞进行可通透性制备。本实验采用先用适宜浓度皂素 （Saponin）先孵育 10min，之后在加肝素孵育 20min。 由以上实验表明，甜菜碱升高细胞内钙离子浓度主要通过以下途径：（1） 在 G 蛋白介导下通过影响 L-型电压门控钙通道的 1亚单位而引起外钙内流； （2）通过影响胞内钙库的 IP3R 钙通道和 RyR 钙通道而引起内钙外排。其共同 引起胞质钙离子浓度增加。 参考文献： 1Atkinson W, Elmslie J, Lever M, et al. Dietary and supplementary betaine: acute effects on plasma betaine and homocysteine concentrations under standard and postmethionine load conditions in healthy male subjectsJ.Am J Clin Nutr. 2008, 87(3):577-85. 2Ji C,Kaplowitz N. Betaine decreases hyperhomocysteinemia, endoplasmic reticu- lum stress, and liver injury in alcohol-fed miceJ.Gastroenterology. 2003,124(5): 1488-99. 3Kim SJ,Jung YS,Kwon do Y,et al. Alleviation of acute ethanol-induced liver injury and impaired metabolomics of S-containing substances by betaine supplementationJ. Biochem Biophys Res Commun.2008, 18;368(4):893-8. 4Du Y,Jiang P,Li Y,et al. Immune responses of two recombinant adenoviruses expressing VP1 antigens of FMDV fused with porcine granulocyte macrophage colony-stimulating factorJ. Vaccine. 2007 28;25(49):8209-19. 5Kitagawa H, Ohta T, Makino I, et al. Carcinomas of the ventral and dorsal pancreas exhibit different patterns of lymphatic spreadJ.Front Biosci. 2008 1;13:2728-35. 6Chopra N,Kannankeril PJ,Yang T,et al. Modest reductions of cardiac calsequestrin increase sarcoplasmic reti