玻璃酸钠的微生物限度检查试验方法的研究

玻璃酸钠的微生物限度检查试验方法的研究玻璃酸钠的微生物限度检查试验方法的研究 苏淮 张兴斌 李洪磊 宋燕 庄会军 贺艳丽 玻璃酸钠（SH）是一种人体生理所必需的黏多糖，它广泛存在于动物的各种 组织中。我国于20世纪80年代开展对SH的研究，随着SH从生化试剂发展到目前具 有较高临床价值的生化药物，针对SH的检测手段也逐步提高，检测项目也全面展 开。SH最突出的特性是分子可结合大量的水，使溶液具有较高的黏度1,2，在对SH 进行微生物限度检查时3，其溶液的高黏度给检测带来一定困难。首先是较难在规 定时间内制备出符合药典要求的供试液，其次是高黏度的溶液较难与培养基混合均 匀，为此我们试用了玻璃酸酶降解法，现将结果报道如下。 1 材料材料 无菌SH，山东福瑞达生物化工公司，批号：HL9014；注射用玻璃酸酶， 1500u/支，上海生物化学制药厂，批号：9709301。 2 方法与结果方法与结果 2.1 对照用菌悬液的制备对照用菌悬液的制备 采用金黄色葡萄球菌作为对照菌，将对照菌按照中国药典2000年版附录的 要求制备出菌悬液，以灭菌生理盐水稀释至约10000个/ml，备用。 2.2 供试液的制备供试液的制备 分别取灭菌磷酸盐缓冲液（NaH2PO4 1.25g，无水Na2HPO4 0.5g，NaCl 4.1g溶 于蒸馏水500ml中）各100ml加至4个灭菌锥形瓶中，分别加入注射用玻璃酸酶20支， 摇匀；3个瓶中分别加入无菌SH 5g，混匀。第4瓶作为稀释液的空白对照。分别取 制备好的菌悬液1ml加入上述4个锥形瓶中，置冷处用台式恒温振荡器振摇4h，取 出于室温放置30min，置42水浴以100次/min的速度振摇，其中第1瓶振摇10min， 第2瓶振摇15min，第3、4瓶振摇20min，即得不同的供试液。 2.3 对照液的制备对照液的制备 取灭菌生理盐水100ml，加入对照用菌悬液1ml，混匀，作为对照液。 2.4 检测检测 2 将供试液及对照液进行稀释、注皿、培养、计数等，具体操作见文献4,5。 2.5 黏度测定黏度测定 取第1、第2及第3瓶供试液进行黏度测定，具体操作按文献4方法进行。 2.6 结果结果 细菌计数结果：第1瓶为65个/ml，且在最低稀释级有菌落连片现象；第2瓶为 97个/ml；第3瓶为105个/ml；第4瓶为99个/ml；对照液为102个/ml。 黏度检测结果为：第1瓶为25.2mm2/s；第2瓶为10.8mm2/s；第3瓶为7.6mm2/s。 检测结果表明，采用玻璃酸酶降解SH可有效降低其水溶液的黏度，42水浴 中以100次/min的速度振摇15min的供试液与对照检测结果基本一致，此法可保证结 果的真实可靠，又使操作可以顺利进行，因此，该法可用作SH微生物限度检查。 3 讨论讨论 采用注射用玻璃酸酶降解SH，既可大幅度降低SH溶液的黏度使操作顺利进行， 又可保证供试品不被污染。 在冷处振摇4h，既使SH在缓冲液中充分溶胀，又使供试品中的细菌休眠，保 证细菌在此条件下无扩增机会，使检测结果能真实反映供试品染菌量。 冷处放置后再置室温放置30min，可使供试品中的细菌复苏，避免在42水浴 中因骤冷骤热受到损伤而导致检测结果偏差。 在42水浴中振摇时间的控制十分关键，因42虽然不是细菌生长的最适宜条 件，但控制不好可能会导致细菌繁殖，使检测结果不能反映供试品的真实状况。从 实验结果看，42振摇10min的玻璃酸酶作用不够充分，供试液较黏，注皿培养不 易摇匀有连片现象，使检测既不利于操作又使检测结果存在偏差；振摇15min可使 玻璃酸酶充分发挥作用，既降低SH的黏度又保证其中细菌数量和活性基本不变； 振摇20min的检测结果虽然与振摇15min的结果基本一致，但其操作时间较长，从 无菌操作的角度考虑我们选择了较短的操作时间。 参考文献参考文献 1 凌沛学，贺艳丽，郭学平，等.透明质酸，北京：中国轻工业出版社， 2002，248254 3 2 王凤山，凌沛学，张天民，等.生化药物研究，北京：人民卫生出版社， 1997，266 3 江腊梅，吴鹰，郭凤仙. 中国生化药物杂志，2001，22（4）：206 4 中国药典二部，2000，附录9