疫苗学知识要点

疫苗绪论 疫苗(Vaccine) ：疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢 产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。 疫苗学(Vaccinology) ：一门关于疫苗理论、疫苗技术、疫苗研制流程、疫苗应用、 疫苗市场及疫苗管理与法规的学科。理论与实践高度结合。 疫苗与药物的区别 使用的人群不同：一般药物主要用于患病人群，疫苗用于健康人 药物的性质：一般药物主要为中药、化学合成药物和生物药物，而疫苗均为生物药物。 药物作用：一般药物主要减轻病痛，只有疫苗才能彻底控制和消灭疾病。 疫苗的成份和特点 疫苗的基本成分包括抗原、佐剂、防腐剂、稳定剂、灭活剂及其他成分 疫苗的成份和特点 抗原：抗原是疫苗最主要的有效活性组分，是决定疫苗的特异免疫原性物质。 （疫苗效果） 佐剂：又称非特异性免疫增生剂。本身不具抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内能 增强免疫原性或改变免疫反应类型 。 杀菌剂/防腐剂： 用于防止外来微生物的污染。一般液体疫苗为避免在保存期间微量污染 的细菌繁殖，均加入适宜的防腐剂。大多数的灭活疫苗都使用防腐剂，如硫柳汞、2苯氧 乙醇、氯仿等。 保护剂或稳定剂： 为保证作为抗原的病毒或其他微生物存活并保持免疫原性，疫苗中常加入适宜的稳 定剂或保护剂，如冻干疫苗中常用的乳糖、明胶、山梨醇等。 灭活剂： 灭活病毒或细菌抗原的方法除了可用物理方法如加热、紫外线照射等之外，也常采用 化学方法灭活。常用的化学灭活试剂有丙酮、酚、甲醛等，这些物质对人体有一定毒害作 用，因此在灭活抗原后必须及时从疫苗中除去，并经严格检测，以保证疫苗的安全性。 疫苗在制备时还需使用缓冲液、盐类等非活性成分。缓冲液的种类、盐类的含量都可 影响疫苗的效力、纯度和安全性，因此都有严格的质量标准。 疫苗的基本特点： 免疫原性 免疫原性由疫苗的抗原所决定，指疫苗接种进入机体后引起抗体产生免疫应答的强 度和持续时间。影响免疫原性强弱的因素包括机体的因素和疫苗的因素。 安全性 安全性包括疫苗本身的安全和接种的安全。大多数疫苗主要用于儿童和健康人群，因 此其安全性要求极高。绝大多数国家以不允许因接种疫苗而发生的死亡率超过百万分之一 作为安全标准之一。 稳定性 疫苗必须保持稳定，以保证经过一定时间的疫苗贮存和冷藏运输过程后疫苗仍能 保持有效的生物活性。稳定性是衡量疫苗质量的一个重要指标。 广泛应用性 当某种传染病流行时，对流行区域的健康人群和易感者进行接种，在保护接种者个 人的同时，随着接种人数的增加，当产生免疫的人数达到人群的 80以上时，整个人群形 成一个免疫屏障，形成群体免疫，避免疾病的流行与传播。 第二章 第二章 疫苗学的基础 一、疫苗学的微生物基础 二、疫苗学的免疫学基础 三、疫苗学的传染病学基础 1、细菌的致病性 （1）病原菌（pathogenic bacteria）： 可导致机体发病的细菌。 条件致病菌（conditional pathogenic bacteria ）： 正常条件下对宿主不呈现致病作用，当机体抵抗力低下的时候可以致病。 （eg.金黄 色葡萄球菌） 1、细菌的致病性 （1）病原菌（pathogenic bacteria） 寄生：据大多数病原菌 腐生：产生毒素 食物 中毒 （eg.肉毒梭菌） （2）致病性（pathogenicity）： 病原菌在特定条件下引起宿主疾病。 毒力（virulence）： 致病力的强弱。 强毒、弱毒（减毒） 、无毒 毒力因子：致病力的物质基础。 侵袭力 毒素 （3）细菌致病的 3 个步骤： 黏附 定殖 扩散 2、细菌的致病机制 致病机制归根结底是由于致病相关基因决定的，这些致病相关基因组成 10-20kb 的 DNA 片段，称为致病岛。 （1）侵袭力（invasiveness）:病原体突破皮肤、粘膜生理屏障，在体内定居、繁殖和扩散。 侵袭力的物质基础 表面结构： 荚膜、黏附素、菌毛 侵袭蛋白：酶 （2）细菌毒素（toxin）： 细菌生长过程中产生和释放的毒性物质。 损伤宿主细胞 干扰生理功能 一、疫苗学的微生物学基础 （一）细菌的致病性与毒力因子 内毒素外毒素 来源革兰阴性菌 革兰阳性菌及少数革兰阴性 菌 产生方式细菌崩解后释放合成分泌到菌体外的 化学成分脂多糖（LPS）蛋白质 稳定性较稳定，耐热 不稳定，易被热、酸和消化 酶灭活 毒性作用 弱，对组织无选择性，各种 内毒素毒性作用相似 强，对组织细胞有高度选择 性，并能引起特殊的病变和 症状医学 抗原性 弱，刺激机体产生抗体作用 弱 强，可刺激机体产生抗毒素， 经 0.3%0.4%甲醛液作用 成类毒素 2、细菌的致病机制 （2）细菌毒素（toxin）： 内毒素的治疗：抗体、内毒素拮抗剂 外毒素的治疗：抗毒素、类毒素 抗毒素：外毒素刺激机体产生特异性抗体，使抗体具有免 疫保护作用。 （破伤风抗毒素） 类毒素：用甲醛处理外毒素，去除有害作用，注射后使机 体产生抵抗细菌的能力。 （白喉类毒素，破伤 风类毒素 ） 3、细菌毒力的测定 （1）半数致死量（median lethal dose， LD50 ）： 是指能使实验动物在感染后一定时限内死亡一半所需要的微生物量。 （2）半数感染量（median infection dose， ID50 ）: 是指能使实验动物在感染后一定时限内感染发病一半所需要的微生物量。 4、细菌干扰或逃避宿主的防御机制 （1）抗吞噬作用 分泌蛋白酶 破坏吞噬细胞 抑制吞噬 多糖荚膜，菌毛 在巨噬细胞中生存 （2）抗体液免疫 伪装抗原 金黄色葡萄球菌 结合血纤维蛋白 白色念球菌 肾小球基底膜 肾小球肾炎 结合抗体 金黄色葡萄球菌 SPA 金黄色葡萄球菌 A 蛋白(Staphylococcal Protein A、 简称 SPA)是细胞壁抗原的主要成分，几乎 90%以上的菌株均含有这种成分，但不同的菌株 含量差别十分悬殊。SPA 占整个细胞壁蛋白成分的 6.7%，通过胞壁肽聚糖以共价键与之结 合。其它葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌不含 SPA （二）病毒的致病作用 1、病毒的传播方式 （1）水平传播 病毒在人群不同个体间的传播 病毒侵入机体的三大重要门户 皮肤 呼吸道 消化道 （2）垂直传播 通过胎盘或产道， 病毒由母亲传给胎儿的方式 胎盘 产道 2、感染的类型 隐性感染 不引起临床症状向外播散病毒 显性感染 出现临床症状 急性感染 持续性感染 慢性感染 病程长, 病毒可检出 如 HBV 潜伏感染： 经感染后，病毒基因存在于组织细胞中，可反复激活，急性发作病毒只有在 急性发作时才被检出如 HSV、VZV 慢发病毒感染：潜伏期长，发病后为亚急性进行性直至死亡 2、病毒的致病机理 杀细胞性感染：多见于无包膜病毒 稳定状态感染：多见于有包膜病毒 整合感染：多见于肿瘤病毒 细胞凋亡 细胞的增生和转化 免疫系统紊乱 3、抗病毒免疫 （1）非特异性免疫 屏障作用 巨噬细胞的作用 干扰素非特异性免疫 （2）特异性免疫： 体液免疫：按种类：IgG IgM IgA 细胞免疫：抗病毒免疫的主要细胞 T、NK 二、疫苗学的免疫学基础 （一）体液免疫 1、体液免疫： 所谓体液免疫（humoral immunity） ，即以 B cells 产生抗体来达到保护目的的免疫机 制。 负责体液免疫的细胞是 B 细胞。体液免疫的抗原多为相对分子质量在 10,000 以上的 蛋白质和多糖大分子，病毒颗粒和细菌表面都带有不同的抗原，所以都能引起体液免疫。 2、体液免疫过程： 第一步：B 细胞表面的受体分子与互补的抗原分子结合后，活化、长大，并迅速分 裂产生一个有同样免疫能力的细胞群克隆(clone)、无性繁殖系。其中一部分成为浆细 胞，产生抗体；一部分发展为记忆细胞(memory cell)。 第二步：在这一阶段，抗原成为被作用的对象，效应 B 细胞产生的抗体可以与相 应的抗原特异性结合，发挥免疫效应， 体液免疫主要对抗细胞外感染。 （二）细胞免疫 指 T 细胞在接受抗原刺激后形成效应 T 细胞和记忆细胞. 效应 T 细胞与靶细胞特异性结合，使靶细胞通透性改变,渗透压发生变化，最终导 致靶细胞破裂死亡。 杀伤特点： 连续性杀伤 特异性杀伤 细胞免疫对抗胞内感染。 MHC 限制性 （三）免疫记忆 免疫记忆（ immunological memory ）： 机体再次接触同一种抗原后产生的增强性快速应答，由记忆淋巴细胞承担。 此外， 免疫记忆还具有抗原特异性和长效性。 免疫记忆的特点是具有抗原特异性和长效性。 记忆 B 细胞 10-60 年（天花） 记忆 T 细胞 10 年 （四）疫苗免疫剂量、途径、次数及间隔 1、免疫剂量 适中 太低/太高 免疫耐受 2、免疫途径 以皮内免疫最佳 皮下免疫次之 腹腔免疫和静脉注射效果最差 口服易导致耐受 粘膜免疫（局部感染） 选择好的免疫佐剂 皮下注射 皮内免疫 静脉免疫 腹腔免疫 口服免疫 粘膜免疫 2、免疫次数和间隔 不同疫苗有所不同 免疫次数 2-3 次 间隔时间 3-4 周 三、疫苗学的传染病学基础 （一）传染病的基本特征（p52 1.有病原体：每种传染病都有其特异的病原体，包括病毒、立克次氏体、细菌、真菌、螺 旋体、原虫等。 2.有传染性：病原体从宿主排出体外，通过一定方式，到达新的易感染者体内，呈现出一 定传染性，其传染强度与病原体种类、数量、毒力、易感者的免疫状态等有关。 3.有流行性、地方性、季节性 （1）流行性：按传染病流行病过程的强度和广度分为。 散发：是指传染病在人群中散在发生； 流行：是指某一地区或某一单位，在某一时期内，某种传染病的发病率，超过了历 年同期的发病水平； 大流行：指某种传染病在一个短时期内迅速传播、蔓延，超过了一般的流行强度； 暴发：指某一局部地区或单位，在短期内突然出现众多的同一种疾病的病人。 （2）地方性：是指某些传染病或寄生虫病，其中间宿主，受地理条件，气温条件变化的影 响，常局限于一定的地理范围内发生。如虫媒传染病，自然疫源性疾病。 （3）季节性：指传染病的发病率，在年度内有季节性升高。此与温度、湿度的改变有 关。 4.有免疫性：传染病痊愈后，人体对同一种传染病病原体产生不感受性，称为免疫。不同 的传染病、病后免疫状态有所不同，有的传染病患病一次后可终身免疫，有的还可感染。 可分为下几种感染现象。 （1）再感染：同一传染病在完全痊愈后，经过一定时间后，被同一种病原体感染。 （2）重复感染：某种疾病在发病中，被同一种病原体再度侵袭而受染。血吸病、丝虫 病、疟疾最为常见。 （3）复发：发病过程已转入恢复期或接近痊愈，而该病原体再度出现并繁殖，而原症 状再度出现。伤寒最为常见。 （4）再燃：临床症状已经缓解，但体温尚未正常而又复上升、症状略见加重。多见 于伤寒。 （二）我国需要重视的传染病 我国目前部分传染病发病率仍居高不下，如病毒性肝炎、流行性出血热、细菌性痢疾等； 部分曾被控制疾病出现流行扩散趋势，如肺结核、性病、血吸虫病、脊灰；但一些新发传 染病也已在我国出现并造成流行，例如艾滋病、疯牛病、SARS、禽流感、猪流感以及超级 细菌。将来还有可能是南北极冰川中的远古病毒。 （三）我国传染病的分类 国家法定传染病分甲，乙，丙三类。 甲类传染病是指：鼠疫、霍乱。 乙类传染病是指：传染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰质炎、人感染 高致病性禽流感、麻疹、流行性出血热、狂犬病、流行性乙型脑炎、登革热、炭疽、细菌 性和阿米巴性痢疾、肺结核、伤寒和副伤寒、流行性脑脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生儿 破伤风、猩红热、布鲁氏菌病、淋病、梅毒、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾。 丙类传染病是指：流行性感冒、流行性腮腺炎、风疹、急性出血性结膜炎、麻风病、 流行性和地方性斑疹伤寒、黑热病、包虫病、丝虫病，除霍乱、细菌性和阿米巴性痢疾、 伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻病。 疫苗接种的目的 正确的选择疫苗（符合流行病学研究） 免疫程序 免疫接种人员 免疫接种的对象（发烧、过敏、妊娠） 第三章 疫苗的种类与研制技术 一、疫苗的分类 二、传统疫苗及其研制技术 三、现代疫苗及其研制技术 四、肿瘤疫苗及其研制技术 一、疫苗的分类 （1）根据使用的对象：人用和兽用 （2）研制技术：传统和新型 （3）抗原的来源：菌苗（类毒素） 、毒苗、虫苗 （4）用途：预防和治疗 （5）根据预防疾病的种类：单价、多价（联合） （6）抗原的化学性质：蛋白、核酸、多糖。 （7）使用方法和接种途径：注射疫苗、口服疫苗、滴鼻疫苗、滴眼疫苗、鼻喷疫苗、皮贴 疫苗、气雾疫苗、微胶囊疫苗、缓释疫苗。 （8）其他命名：T 细胞疫苗、树突细胞疫苗、植物疫苗、重组 XXX 疫苗。 二、传统疫苗及其研制技术 （一）传统疫苗的主要类型 传统疫苗包括灭活疫苗、减毒活疫苗和用天然微生物的某些成分制成的亚单位（组 分）疫苗。 1、灭活疫苗(Inactivated vaccine) 灭活疫苗是用免疫原性强的病原微生物或其代谢产物，接种于动物、鸡胚、组织或 细胞培养物中生长繁殖后、经灭活处理使其失去致病力，但仍保留完整的生物结构和免疫 原性。 疫苗中含有的菌体或病毒颗粒是“死”的，因此又称作死疫苗。 2、弱毒疫苗（Attenuated vaccine） 弱（减）毒活疫苗是通过不同的方法手段，使病原体的毒力即致病性减弱或丧失后 获得的一种由完整的微生物组成的疫苗制品。因其中的微生物体是活的，因此也叫活苗。 3、亚单位（组分）疫苗 亚单位疫苗（Subunit vaccine） （组分疫苗）指的是除去病原体中无免疫保护作用的有 害成分，保留其有效的免疫原成分制成疫苗。 例如：研究者用化学试剂裂解流感病毒，提出其血凝素、神经氨酸酶制成流感病 毒亚单位苗；用脑膜炎球菌夹膜多糖制成亚单位疫苗。 三类传统疫苗的比较 制制品品纯纯度度高高、副副反反 应应小小、需需多多次次接接种种 一一般般要要接接种种2-3次次，反反 应应较较大大，维维持持时时间间较较 短短，稳稳定定性性好好，较较安安 全全 接接种种次次数数少少，反反应应 小小，免免疫疫效效果果持持久久， 稳稳定定性性较较差差，并并应应考考 虑虑毒毒力力返返祖祖 优优缺缺点点 病病原原微微生生物物组组分分接接 种种后后能能刺刺激激机机 体体产产生生特特异异性性 免免疫疫反反应应 病病原原体体失失去去毒毒力力但但保保 持持免免疫疫原原性性，接接种种后后 产产生生特特异异抗抗体体或或致致敏敏 淋淋巴巴细细胞胞 接接种种后后的的病病原原体体在在体体 内内有有一一定定生生长长繁繁殖殖的的 能能力力，类类似似隐隐性性感感 染染，产产生生细细胞胞、体体液液 和和局局部部免免疫疫 免免疫疫机机理理 以以化化学学方方法法获获得得病病 原原体体的的某某些些具具免免疫疫 原原性性的的成成分分 用用化化学学或或物物理理的的方方法法 将将病病原原体体杀杀死死 用用减减毒毒或或无无毒毒的的全全病病 原原体体作作为为抗抗原原 抗抗原原制制备备 亚亚单单位位疫疫苗苗灭灭活活疫疫苗苗活活疫疫苗苗项项目目 制制品品纯纯度度高高、副副反反 应应小小、需需多多次次接接种种 一一般般要要接接种种2-3次次，反反 应应较较大大，维维持持时时间间较较 短短，稳稳定定性性好好，较较安安 全全 接接种种次次数数少少，反反应应 小小，免免疫疫效效果果持持久久， 稳稳定定性性较较差差，并并应应考考 虑虑毒毒力力返返祖祖 优优缺缺点点 病病原原微微生生物物组组分分接接 种种后后能能刺刺激激机机 体体产产生生特特异异性性 免免疫疫反反应应 病病原原体体失失去去毒毒力力但但保保 持持免免疫疫原原性性，接接种种后后 产产生生特特异异抗抗体体或或致致敏敏 淋淋巴巴细细胞胞 接接种种后后的的病病原原体体在在体体 内内有有一一定定生生长长繁繁殖殖的的 能能力力，类类似似隐隐性性感感 染染，产产生生细细胞胞、体体液液 和和局局部部免免疫疫 免免疫疫机机理理 以以化化学学方方法法获获得得病病 原原体体的的某某些些具具免免疫疫 原原性性的的成成分分 用用化化学学或或物物理理的的方方法法 将将病病原原体体杀杀死死 用用减减毒毒或或无无毒毒的的全全病病 原原体体作作为为抗抗原原 抗抗原原制制备备 亚亚单单位位疫疫苗苗灭灭活活疫疫苗苗活活疫疫苗苗项项目目 （二）传统疫苗的研制技术 1、灭活疫苗研制技术 （1）研制原则 用于制备灭活疫苗的菌（毒）种，应该基本符合以下条件： 必需具有很强的免疫原性，能诱发机体产生特异的免疫力足以阻止相应病原体的入侵或 防止机体发生相应的疾病； 应具有恒定的培养特性、生化特性、稳定的遗传性； 应易于在人工培养基上或持定的组织或细胞中培养并可进行规模化生产； 在培养过程中不产生或产生较小的毒性： 制备类毒素的菌种在培养过程中能产生大量的典型毒素； 要针对不同的病原血清型选择符合当地流行的菌株，以保证所制造的疫苗具有良好的免 疫效果，同时对同型菌、毒株要求选择能产生最好保护效果的品种，对多血清型的病原则 应选择抗原谱广、保护面宽的血清型。 （2）灭活剂的选用 灭活疫苗的制备技术主要是微生物病原体的培养、抗原的灭活与提纯处理，其中灭 活病原体是关键步骤之一。 疫苗灭活方法对机体免疫应答会产生明显影响现今生产灭活疫苗的灭活方法可分为 物理和化学两大类。 A、物理作用灭活 制备灭活疫苗最初采用的灭活方法是物理方法，主要有加热、紫外线和射线灭活。 加热灭活： 在 19 世纪末，基本上都是采用加热的方法对病原体进行灭活。 加热灭活法的原理是使蛋白质变性从而使病原体失去传染性。治疗用布氏杆菌疫苗、 伤寒疫苗同样是通过加热方法灭活的。 紫外线灭活： 紫外线灭活主要是作用于病原体的 DNA 和/或 RNA，使病原体的 DNA 形成 TT 二聚体，致使无法以此 DNA 为模板转录为 mRNA，不能复制子代 DNA 与合成蛋白。 从而使病原体失去感染性。 此种灭活方法的优点是在 DNA、RNA 水平对病原体进行灭活，最大限度地 保留了抗原的完整性和免疫原性。 射线灭活： 射线灭活（-射线照射 ）的原理是射线可直接破坏细菌和病毒的 DNA 或 RNA， 导致微生物死亡。射线灭菌的优点是不升高灭菌产品的温度、穿透性强、灭活效率高。 缺点是设备费用较高，对操作人员存在潜在的危险性。 B、化学作用灭活 化学方法是现在应用的主要灭活方法，使用的灭活剂有福尔马林、丙酮、苯 酚、-丙内酯、乙烯亚胺 、双乙烯亚胺等。 甲醛： 福尔马林是传统的灭活剂，应用最广泛。 原理： 甲醛直接作用于细菌蛋白质分子上的氨基（NH2） 、硫氢基（SH） 、羧基（COOH） ， 生成次甲基衍生物，从而破坏细菌蛋白质（尤其是酶类） ，但不明显影响其免疫原性。 甲醛灭活菌体后，应产生两种免疫原：一类是天然的抗原，即构象甲醛破坏 的抗原，一类是被甲醛破坏后形成的新抗原。 苯酚： 苯酚损害细胞的细胞膜使细菌溶解、蛋白质变性、酶失活。通常用量为 1-3%， 细菌芽孢和病毒对于苯酚的耐受性较强。 中和剂：2-3% 吐温-80 -丙内酯 ： -丙内酯（Beta-Propiolactone，BPL）现已广泛地应用于多种人和动物疫苗的生 产。其作用机理可能是作用于病原体的 DNA 和 RNA，而不直接作用于蛋白。它能在机体 内完全分解为无毒性的 -羟丙酸，这是一种人体内脂肪代谢后的产物，对人体和动物体无 毒。 缺点：本身具有致癌性， BPL 可以改变人血清白蛋白的性质， 2、弱毒疫苗研制技术 （1）利用病原自然弱毒株 某些传染病的病原在自然界中存在着具有免疫原性的自然弱毒株。可以用于 生产活疫苗。 （2）异源免疫 异源免疫（heterologous immunity）选择与病原有一定 “亲缘”关系，在分类 上同属不同种，具有一定的交叉免疫原性，而天然宿主又不相同的微生物株系作为疫苗株。 （3）人工在异源动物或细胞上传代致弱 在异源动物体内或组织细胞培养中连续传代以减弱病原的致病性，以人工致弱 的病原来制作活疫苗。到目前为止，用来预防人类和家畜传染病的活疫苗的菌种和病毒种， 大部分都以这种方式培育。 （4）改变体外培养传代的环境 在体外培养传代病原株时，改变培养的温度（提高或降低） ，或者在培养基中加入 抑制病原的化学物质或诱变剂以及在体外以射线处理病原微生物，这种环境不利于正常微 生物的发育，但却可能有利于某些突变株的发育，这些突变株在正常环境中不易生长发育 而死亡，从而有助于弱毒株的培育。 3、组分疫苗的研制技术 组分疫苗又可称为裂解疫苗既可以是蛋白质疫苗，也可以是多糖疫苗。 蛋白质疫苗包括类毒素（灭活细菌毒素）和病毒裂解的亚单位或亚毒粒制品。 大多数多糖疫苗由来自细菌的纯化了的细胞壁多聚糖组成。 结合多糖疫苗是将多聚糖用化学方法与蛋白质连接而得到的疫苗，这种连接使多 糖成为更有效的疫苗。 三、现代疫苗及其研制技术 现代疫苗的主要类型： 现代疫苗包括合成多肽疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗、T 细胞疫苗、树突细胞疫 苗以及避孕疫苗和肿瘤疫苗。 基因工程疫苗 基因工程亚单位疫苗 基因缺失疫苗 重组活载体疫苗 （一）合成肽疫苗及其研制技术 1、概念 合成多肽疫苗（synthetic peptide vaccine）是用化学手段合成病原微生物的保护性多 肽或表位并将其连接到大分子载体上，再加入佐剂制成的疫苗。 优点： （1）安全 （2）可在同一载体上连接多种保护性肽链或多个血清型的保护性抗原肽链。 （如： 口蹄疫合成肽疫苗、乙型肝炎和疟疾合成肽疫苗 ） 缺点： 该类疫苗的缺点是制造成本较高。 2、研制技术 (1)多肽的化学合成 首先应该确定天然抗原的氨基酸序列(基因测序)，选择和确定有效肽段（中和抗体） ， 并寻找该肽段所针对的抗原决定簇（计算机分析） 。 其次应选择合适的合成方法。主要有两个合成策略：片段浓缩法和固相合成法。 片段浓缩法是经典的合成技术。首先合成数条小肽，经纯化和去保护后结合成较长的 肽，直到最后所需的序列。 固相合成法是将肽链一端结合于固相载体上的方法，通过在 N-末端逐步加上氨基酸 的方法合成肽段。 (2)载体的选择 合成的多肽可以联接或结合到载体上。 （蛋白质、多聚体、脂多糖、脂质体） 选择载体时应谨慎，因为机体对载体的免疫应答可能会掩蔽对肽的免疫应答。 (3)与人体组织是否存在交叉反应 抗肽抗体可能与人体组织产生意想不到的交叉反应，也可引发自身免疫反应。 偶合或聚合反应能产生新的表位，而仅仅评价肽单体不能解决该问题。 因此，应使用人体组织测定疫苗的最后配方及佐剂是否产生意外的交叉抗体。 （二）亚单位疫苗及其研制技术 1、概念 基因工程亚单位疫苗又称重组亚单位苗（recombinant subunit vaccine） ，是指将病原体保护 性抗原基因在原核或真核系统中表达，再以表达产物制成亚单位苗。 2、亚单位疫苗优点 （1）首先是安全性好，疫苗中不含有活性的完整病原体，接种后不会发生急性、持续或潜 伏感染，可适用于一些不利于使用活疫苗的情况，如幼龄的动物或人、妊娠动物或人。 （2）其次，这些疫苗减少或消除了常规活疫苗或死疫苗难以避免的热原、变应原、免疫抑 制原。 （3）亚单位疫苗所产生的免疫应答可以与感染产生的免疫应答相区别，因此更适合于疫病 的控制和消灭计划。 （4）可以表达高度致病性的危险病原体及难于进行体外培养病原体的免疫原性蛋白质，可 大量发酵生产，增加了安全性和抗原的生产效率。 缺点 生产成本比较高（纯化） 产品研发成本高 免疫接种成本高（多次注射） 3、亚单位疫苗研制原则 （1）免疫保护性基因的确定。 （2）外源免疫保护性抗原表达系统的选择。 生物表达系统 原核生物表达系统（大肠杆菌，乳酸菌，枯草杆菌） 真核生物表达系统（酵母，丝状真菌，哺乳动物，昆虫） （三）基因缺失疫苗及其研制技术 1、概念 基因缺失疫苗（deletion-mutant vaccine）是用基因工程技术将病毒或细菌的致病性 基因进行缺失，从而获得弱毒株活疫苗。 2、基因缺失疫苗的优点和缺点 优点： （1）安全性好。 基因缺失疫苗的基因的变化，一般不是点突变。故其毒力更为稳定，返祖突变机率 更小，疫苗安全性好。 （经典技术培育的弱毒株常是基因点突变） 。 （2）免疫原性好 其免疫接种与强毒感染相似，机体可对病毒的多种抗原产生免疫应答；免疫力强， 免疫期长，尤其是适于局部接种，诱导产生黏膜免疫力，因而是较理想的疫苗。 缺点： 基因缺失病毒在自然状态下可能与野毒株发生重组或者发生核酸修补，使疫苗株原 来缺失的基因恢复而重新获得毒力。并且有的基因缺失疫苗对孕畜和仔畜的毒力偏高。 3、基因缺失疫苗研制原则 构建基因缺失疫苗时，应该保证缺失的基因为病毒或细菌复制的非必需基因，否则 产生的病毒不具有复制能力。 四）重组活载体疫苗及其研制技术 1、概念 基因工程重组活载体疫苗（recombinant live-vector vaccine）是用基因工程技术 将 外源保护性抗原基因插入病毒或细菌（常为疫苗弱毒株）中使之表达的活疫苗。 2、重组活载体疫苗的优点和缺点 优点： （1）具有活疫苗的免疫效力高、接种成本低的优点。 （2）若选择在毒力基因中插入外源基因，则弱毒株的毒力会进一步降低，疫苗的安 全性也更好。 （3）可同时插入多个外源基因，构建多价疫苗。 缺点： （1）某些外源片断表达效率低，而且容易丢失。 （2）有时因机体对活载体的免疫反应性质，可限制再次免疫的效果。 （痘病毒） 3、重组活载体疫苗的种类 重组病毒活载体疫苗 重组痘病毒活载体疫苗 重组腺病毒活载体疫苗 重组疱疹病毒活载体疫苗 重组小 RNA 病毒活载体疫苗 重组细菌活载体疫苗 沙门氏菌、李斯特氏菌 乳酸菌 4、重组活载体疫苗研制原则 （1）载体的选择 载体的安全性。 弱毒疫苗株 在插入外源基因后可以使其致病力降低的细菌或病毒 活载体（病毒或细菌）的组织嗜性应该与其所表达外源抗原所属微生物的组织嗜性相同 或相近。 活载体对外源基因的容量，不同病毒其外源基因含量不同，如果想要构建多价疫苗需要 一个基因组较大、容纳外源基因较多的载体。 （如：痘病毒） （2）转移载体的构建 构建重组病毒活载体疫苗的关键是构建一个成功转移载体，利用其通过同源重组的作用将 外源基因整合于载体病毒的基因组中。一个转移性能良好的载体应该具备以下条件： 拥有足够长的同源臂序列（即供体和受体都具有的相同的碱基序列）一般在 800-1000bp 左右，也有报道 300bp 就可以满足同源重组的需求； 一个适宜的启动子，启动子应该与载体病毒相适应，最好是载体病毒自身基因的启动子。 （3）外源基因插入位点的选择 原则上讲外源基因的插入不应该影响载体病毒或细菌自身的复制，所以外源基因应该插入 载体病毒或细菌基因组的非必需基因中。 为了降低载体的致病力，还可以在不影响复制的情况下将外源基因插入到载体的毒力基因 中。 （五）核酸疫苗及其研制技术 核酸疫苗（nucleic acid vaccine）又称基因疫苗，是指将编码某种抗原蛋白的 基因直接导入动物细胞，在宿主细胞中表达并合成抗原蛋白，激起机体一系列类似于疫苗 接种的免疫应答， 起到预防和治疗疾病的目的。 1、核酸疫苗的优点 A、几乎等同于感染病原体或弱毒疫苗免疫后所产生的免疫应答。 B、核酸疫苗具有共同的理化特性， 。 C、安全性好， D、制备简单， E 生产成本降低，并能加工干燥，便于储藏和运输。 2、核酸疫苗的研制技术 核酸疫苗是由编码病原体抗原的基因和作为真核细胞表达载体的质粒 DNA 组成。 病原体抗原的基因 单一病原体免疫保护性抗原基因 多个病原体的免疫保护型基因 编码抗原决定簇的一段 DNA 序列 质粒 DNA：用于构建核酸疫苗的载体质粒基本骨架 启动子 增强子 3端多聚 A 信号（poly A） 3、核酸疫苗的接种方式 核酸疫苗可以通过多种方式和途径接种到机体的适当部位，不同的接种方式或途径 可影响其免疫效果。 普通注射 动物病毒和一般哺乳动物启动子：骨骼肌，如：股四头肌和腓肠肌 乳清酸蛋白（WAP）启动子：乳腺和皮下脂肪 基因枪接种：将包裹在金粒上的质粒 DNA 直接射入进表皮细胞 （六）T 细胞疫苗 致病性 T 细胞 自身反应性 T 细胞：引起自身免疫性疾病 同种反应性 T 细胞：导致同种移植排斥反应 活化、灭活 T 细胞疫苗(T cell vaccination, TCV) 将自身反应性 T 细胞或同种反应性 T 细胞活化并灭活后作为疫苗。 可诱导机体产生针对致病性 T 细胞的免疫应答，从而消除或减轻这些细胞的致病作用。达 到对自身免疫性疾病和对同种移植物排斥的防治作用。 传统 T 细胞疫苗的应用：用于治疗系统性红斑狼疮 从患者血液中分离致病性 T 淋巴细胞 在体外培养形成 T 细胞克隆后，用 射线照 射 经皮下注射对患者进行治疗 首次注射后第 2、6、8 周重复注射 治疗评价 此项治疗的安全性和近期有效性方面均较理想，且一般无广泛免疫抑制的副作用，其作用 机制可能与注射后引起体内自身反应性 T 淋巴细胞清除等相关。 与干细胞移植相比，T 细胞疫苗在特异性、风险和费用方面更具优势。患者在治 疗后，临床症状和检验指标均有不同程度改善，系统性红斑狼疮病情活动指数也得以下降。 现代 依据 MHC-I 类分子特异的多肽结合基序合成的多肽 在体外诱导产生的抗原特异性细胞毒 T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL） 将 CTL 克隆、扩增、筛选和鉴定后，注射入机体用于治疗病毒性疾病 （七）树突细胞疫苗 1、树突细胞 树突状细胞（Dendritic cell，DC）是专职抗原递呈细胞（APC） ，能有效地将抗原递呈给 T 淋巴细胞，从而诱导 CTL 活化。 3、树突细胞疫苗 荷载抗原的 DC 具有疫苗的功能，故称为树突状细胞疫苗（dendritic cell vaccine） 。 荷载抗原 病毒抗原 HLA 向 CTL 提呈病原体表位（8-10 个氨基酸的短肽） 肿瘤细胞成分 编码肿瘤的抗原 4、树突细胞疫苗研制技术 两大关键步骤 获得大量的 DC 细胞 A、 DC 的分离 DC 可以由 CD34+或 CD14+细胞中产生，存在于人骨髓、脐血和成年人外周血中 的 CD34+细胞。 B、 DC 的培养 添加必须的细胞因子： GM-CSF（granulocyte-macrophage colony stimulating factor, 粒/巨噬细胞集落刺激因子） flt3-L（flt3 ligand，酪氨酸激酶受体 3 配体） 致敏的 DC 直接致敏 肿瘤提取物致敏 DC 肿瘤细胞与 DC 的融合 肿瘤抗原肽或蛋白体外致敏 DC 核酸致敏 DC ：肿瘤细胞来源的 RNA 致敏 DC 基因转染 DC ：脂质体、电穿孔及磷酸钙 ；病毒载体 （八）肿瘤疫苗 1、肿瘤概述 （1）免疫系统的功能 对外防御 入侵的病原微生物/毒素 移植的外来细胞和组织 对内清洁 损伤衰老的细胞 肿瘤细胞 （2）肿瘤的概念 肿瘤（Tumor）是机体中的正常细胞在各种外部致病因素和内部遗传因素的长期共同影响 和作用下，发生过度增生和异常分化所形成的新生物。 2、肿瘤与免疫系统 （1）肿瘤抗原 肿瘤抗原（tumor antigen）泛指在肿瘤发生、发展过程中新出现或过度表达的新抗原物质。 肿瘤特异性抗原：只存在于肿瘤细胞而不存在与正常细胞 肿瘤相关抗原：存在与肿瘤细胞与某些正常细胞 （2）肿瘤免疫 细胞免疫为主，体液免疫为辅 体液免疫 激活补体系统溶解肿瘤细胞 抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用 抗体的调理作用 抗体封闭肿瘤细胞上的某些受体 抗体使肿瘤细胞的粘附特性改变或丧失 肿瘤细胞疫苗 肿瘤细胞疫苗是从机体肿瘤组织中提取肿瘤细胞，经灭活处理后使瘤细胞丧失致瘤性，但 仍保持其免疫原性，然后对机体进行主动免疫。 通常采用在疫苗中加入诱导免疫应答的细胞因子，如 IL-2 、IL4 和 GM-CSF 等。 （2）基因修饰肿瘤细胞疫苗 转染分子有：MHC I 类分子 共同刺激信号 B7 分子 各种细胞因子及其受体 （九）避孕疫苗 又称抗生育疫苗，是采取人工方法通过注射或口服生育相关抗原，在机体内产生特异性抗 体或免疫细胞，干扰精卵结合能力或阻止着床，造成一定时间内可逆性的、无不良反应的 不孕的一类疫苗。 人绒毛绒促性腺激素（hCG） 其作用与促黄体激素（LH）相似，可刺激和维持黄体功能，促使其分泌雌激素和 孕酮，以维持子宫内膜增生和形成蜕膜变化，有利于受精卵生长。 下丘脑促性腺释放激素（GnRH） 是由下丘脑合成的一个 10 肽激素。它调节垂体的性腺激素：促黄体激素（LH） 和促滤泡激素（FSH）的合成，是精子和卵子发生的关键调节性物质。 促黄体生成素（LH） 由垂体产生的一种激素。在男性中能刺激睾丸间质细胞分泌男性雄激素，在女性 中刺激卵巢分泌女性雌激素。 促滤泡激素（FSH） 作用于男性的生精上皮，刺激青春期男性精子的生成。作用于女性卵巢促进卵泡 颗粒层细胞增生分化，促进卵巢长大。 第四章 免疫佐剂 一、免疫佐剂的概念 免疫佐剂（immunoadjuvant）又称佐剂或非特异性免疫增强剂。 其本身不具有抗原性，同抗原一起或预先注射到机体， 能增强抗原的免疫原性或者改变抗原诱导的免疫反应类型。 二、免疫佐剂的简史 弗氏完全佐剂 由石蜡油、去垢剂羊毛脂和灭活的分枝杆菌（卡介苗）组成的弗氏佐剂。 弗氏不完全佐剂 弗氏不完全佐剂用于加强免疫刺激。为了减少副作用，不含结核分枝杆菌成分。 三、免疫佐剂的分类 矿物质 油乳佐剂 微生物佐剂 脂质体和 Novasomes 中草药类 细胞因子 药物类佐剂 生物降解聚合微球 四、免疫佐剂的作用机制 1、抗原物质与佐剂混合后，改变了抗原的物理性状，可储备抗原，使抗原物质缓慢释放， 延长抗原作用时间。 2、佐剂吸附抗原后，增加抗原表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬。 3、佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理，可与抗原提呈细胞（APC）作用促进抗原的提呈。 4、佐剂可以增强免疫细胞之间的相互作用，增强辅助 T 细胞的作用，发挥免疫调节作用。 5、可刺激淋巴细胞分裂和浆细胞产生抗体，使无免疫原性的物质变成有效免疫原。 6、改变抗体产生的类型以及产生迟发型超敏反应，并使其增强。 7、提高机体初次免疫和再次免疫抗体的滴度。 第五章 疫苗的设计 一、疫苗靶抗原的选择 二、疫苗靶抗原的表达设计 三、疫苗靶抗原的纯化设计 四、疫苗流行病学设计 一、疫苗靶抗原的选择 可以刺激机体产生特异性免疫保护性应答的抗原物质。 免疫保护性抗原：一种病原体相关的抗原表位，能刺激机体产生保护性免疫应答，以抵御 该病原体的感染。 对于全病原体疫苗不需要考虑靶抗原选择的问题。 需要考虑的是菌种和毒种的选育。 抗原多肽选择的基本原则 1、尽可能是在蛋白表面 2、保证该段序列不形成 -helix 3、N,C 端的肽段比中间的肽段更好 4、避免蛋白内部重复或接近重复段的序列 5、避免同源性太强的肽段 6、序列中不能有太多的 Pro，但有一两个 Pro 有好处，可以使肽链结构相对稳定一些，对 产生特异性抗体有益。 二、疫苗靶抗原表达系统设计 1、目的基因的来源，如果是大肠杆菌来源的基因，选择大肠杆菌作为表达系统较好，这主 要是考虑到与目的基因来源相同的宿主对于保证蛋白的活性较有利且基因遗传密码的偏爱 性较一致。 2、生产的成本和工艺放大要求。 3、 研究周期和可操作性。 4、蛋白的用途和用量 5、 蛋白的天然性质。 大肠杆菌的分泌很难进入培养基，通常是在周质空间积累 6、 知识产权的考虑 三、疫苗靶抗原的纯化设计 灭活疫苗或减毒疫苗来源于经减毒或灭活工艺而得的活病原体，疫苗由全颗粒菌体或病毒 组成，其纯制过程主要在于去除病毒核酸和杂蛋白，一般只涉及简单分离。 四、疫苗流行病学设计 （一）调查对象的选定 1、地域分布 2、高危人群 3、易感年龄 4、高发季节 （二）现场调查的设计原则 重复、对照、随机、双盲 （三）现场调查时间 初次免疫-传染病流行的前 1-2 月 加强免疫-传染病流行的前 1-2 周 （四）观察时期 短期效果 一个流行季节/年度 长期效果 流行年度/更长时间 第六章 疫苗的检定和评价 正规的生产部门 质量保证（QA） 质量保证就是按照一定的标准生产产品的承诺、规范、标准。 质量检定（QC） 又称质量控制，是为了通过监视质量形成过程，消除质量环上所有阶段 引起不合格或不满意效果的因素。 疫苗质量检测 体外检定（ in vitro） 体内检定（in vivo） 疫苗的体外检定 疫苗的微生物学检测 疫苗的化学、物理和生物化学 环节 研制流水线测定 半成品 成品 1、无菌检验 死苗的成品和半成品 无细胞的疫苗：基因工程亚单位疫苗、 核酸疫苗、多糖疫苗 疫苗制造时的关键试剂 A、抽样 原则：监测方法的灵敏度和疫苗的有效使用剂量。 （不仅限于此项检验） 原液或半成品抽样，应该至少有总量的 0.1%或者不少于 10ml，每开一次瓶，应再抽样一 次； 成品超过 20 瓶，抽样比例不少于 10%；若每瓶装 1ml，则全部用于检测。超过 1ml 抽取代表性比例，不超过 10ml。 疫苗制造的无菌用水，应在输水线不同部位每日抽检。 B、无菌实验用培养基 用灵敏细菌作培养基有效性检查。 常用的标准细菌：芽胞菌和无芽胞菌。 C、培养方法 不含防腐剂/杀菌剂： 小于 5ml/包装，每批混合 10 个包装单位 大于 5ml/包装，每批混合 7 个包装单位 含防腐剂/杀菌剂： 取液体培养基量 2-5%的样品 检菌阳性： 1、细菌的形态学观察、染色鉴定、生化鉴定 2、取双倍样品重复实验 D、支原体检查 需要进行检查的制品： 1、培养病毒的宿主细胞：主细胞库，工作细胞库； 2、病毒的种子批； 3、体外培养细胞生产的活病毒在纯化和过滤前的半成品； 4、体外培养细胞生产的活病毒用于制备灭活疫苗，在灭活前半成品。 细胞库 是用来培养生产连续多批生物制品的细胞系统。 原始细胞库 主细胞库 工作细胞库 细胞库背景资料：1）来源：组织来源，培养方法，传代过程，培养和保存情况及所用培养 基等；2）特性：形态、生长特性、倍增时间；3）遗传特征：表型、基因特征、细胞核型 及标记染色体；若是生产用工程细胞，则需要有载体构建资料或细胞融合资料，基因拷倍 数，稳定性等指标；4）外源因子检测报告：有无支原体、细菌、真菌、病毒和逆转录病毒 等污染。 1、 原始细胞库（Primary Cell Bank，PCB）：只作为种子细胞保存，一般情况不取出。是 一定量经过充分鉴定的原始细胞，组成均一，冻存于液氮罐内，约 10-20 支。其中一支可 用于制备主细胞库。 2 、主细胞库(Master Cell Bank，MCB)：经过充分鉴定一定量的由原始细胞库筛选获得的 亚克隆细胞株，扩大培养传代次数 810 代，组成均一，冻存于液氮罐内，用于制备工作细 胞库。 3 工作细胞库(Working Cell Bank，WCB)：由有限传代水平的主细胞库制备而来的均一性 细胞，按生产条件传代培养，培养传代次数 8-10 代，冻存于液氮罐内用于生产，一旦移出 后不再返回原种子贮存库中。 4、杂病毒的检查 （1）组织培养法：选定无病毒的细胞系，连续传代 2-3 次，接种待测样品，用怀疑病毒的 特异性抗体进行免疫荧光检测。 （2）电子显微镜检查。 （3）PCR 或者 RT-PCR 检查：病毒污染数量不多。 （4）接种实验动物，观察发病情况。 （二） 、疫苗的成份的化学、物理和生物化学测定 依据：中国生物制品化学鉴定规范 要求：灵敏、快速、准确 目的：区分有效成份和杂质 内容：物理性状、抗原含量、纯度测定、有害物质含量 特点：每种制品要求不同，新增项目需要通过认证并编 入规程。 （一）疫苗的免疫效果评价 实验室评价 流行病学评价 实验室实验 临床实验 新疫苗研制在做 I 期临床实验时，必须有动物实验数据。 1、疫苗的动物实验 使用最多的是小鼠 1、价格便宜 2、易于操控，可使用数量较多，用于统计学结果分析 3、免疫背景和遗传背景清晰 选用实验动物的原则： A、针对研究的目的 安全性实验：对毒性物质敏感的动物 免疫效果实验：免疫系统与疫苗应用的目标动物 相近的实验动物。 （人，本动物） B、接种途径：模拟自然感染 C、经济允许且可充分供应：小动物，长期使用 D、操作方便 保护性免疫力实验： 主动保护性免疫力实验 不同剂量的疫苗以适当途径接种实验动物，适当时间后，以适 当剂量的活病原体攻击实验动物，与未免疫的正常动物做对比， 计算免疫组的发病率和致死率。 被动保护性免疫力实验 不同剂量的疫苗以适当途径接种实验动物，适当时间后，取含 抗体的血清或有免疫力的细胞接种同种或异种动物，以适当 剂量的活病原体攻击实验动物，与未免疫的正常动物做对比， 计算免疫组的发病率和致死率。 （二）疫苗的安全性评价 1、毒性实验：（毒理学） 疫苗中的某些成份，会引起对机体或体外培养细胞的毒害性反映 2、毒力实验： 残余毒力：病原微生物变异后失去了主要的致病力， 但有时仍能引起机体轻微的病理反应。 毒力返祖：病原微生物变异后失去了致病力，在某些 情况下重新获得致病力。 第七章疫苗研制的程序 第一节：临床前研究 一、用于疫苗研究的菌种 研究疫苗所用的菌毒种必须证明为引起本病的细菌、病毒或其他病原体，如该菌毒株分离 自人体，下述内容必须清楚。 1菌毒株名称 （人名、地名等） 2菌毒株来源 分离菌毒株的宿主一般情况； 发病地点、发病日期； 临床确诊日期、实验室确诊日期； 病人病程及病人转归。 3菌毒株分离原样本： 咽拭子、漱口液、痰液、血液、粪便、尿液、尸解标本的组织名 称；取样日期；取样时病人的病期。 鉴于人类的血液在同一时间内较少感染多种病毒或细菌，而咽试子、漱口液、痰液、 尿液、粪便等样品难免污染其他外源因子，因此用病人血液分离的菌、毒株较适宜用于研 究疫苗。 4分离菌、毒株的其他自然样本名称、来源、数量、取样方法等。 （二）菌、毒株分离过程 1用细胞分离病毒，所用细胞名称、代次、来源应清楚，应进行细胞无菌检测、支原 体和外原因子等检测；病毒分离不宜使用肿瘤原性的细胞系。尽可能使用非肿瘤原性细胞， 如人二倍体细胞或 Vero 细胞等。 2用动物分离病毒，对所用动物名称、品系、级别、年龄、接种途径、饲养条件和制 备毒种的动物脏器名称等须详细记载；如再适应到细胞，则还应参照上述对分离用细胞的 要求。 3确定分离菌株所用培养基名称、种类，以及分离培养的温度和条件。 （三）菌、毒株分离传代特性 应包括样品处理方法、首次盲传确证菌毒株阳性代次、菌毒株确证检定方法、每代培 养天数、病毒滴度、滴定方法、动物是否发病或死亡等资料。 (盲传：本概念一