生化分析仪基本参数的原理

了解生化分析仪基本参数的原理，有利于仪器、试剂的正确使用，有 助于正确分析和处理测定数据。但是，配套系统的原装分析参数不宜 更改；采用非仪器配套的试剂及校准品体系时，参数修改要慎重，对 于不同仪器、不同类型的反应分析程序，所显示的人机对话分析参数 信息有所不同。 一、反应监测时间 对于终点法来说，读取反应达到 平衡时的吸光度计算样品中待测物的浓度。对于连续监测法来说，要 注意观察反应进程曲线，从而确定反应的预孵育期，延迟时间、连续 监测的时段。对于一级或伪一级反应来说，连续监测的时间是一级反 应的动态期的吸光度；对于基于零级 反应的酶催化活性浓度速率法测 定，连续监测的是零级线性反应期的吸光度。对于连续监测法来说， 动态反应期的时间越长，越适用于临床应用，对于以酶为工具的代谢 物酶促动力测定法，要增加动态反应期，即延长反应达到平衡的时间， 可在反应体系中加入竞争性抑制剂 ，这样还可以提高测定的线性范围， 对于酶催化活性浓度连续监测法来说，一定要注意线性反应时间，有 的酶，例如，以硫代丁酰胆碱为底物的血清假性胆碱酯酶速率测定法， 线性反应时间只有 90 秒。对于连续监测法来说，在监测期至少应读 4 个点(3 个A)。 多数全自动生化分析仪可以在整个测定反应周期连续监测(如 HITACHI 7170 常规测定周期 10 分钟、监测 34 点，OLYMPUS AU 600 固定周期 8 分 15 秒、监测 27 点)，但反应监测时间是指该时间内的测定读数要用 于结果计算。它的设置与加样点、加试剂点( 包括 R1、R2)、监测 时间(读数点)、读数间隔时间及试剂样品比例等有关，要结合方法学， 兼顾权衡。 1反应时间(Reaction Time) 指仪器的一个分析周期中，试剂和样 品混合最末一点测定读数时间。它对终点法尤其重要，是终点法的瓶 颈。有的仪器多个反应时间可选 L 如 HlTACHI 7170)，须预先选定。 多数仪器 10 分钟左右，这对试剂提出了较高要求。不少终点法试剂 (尤其手工法试剂)反应时间常常也在 l O 分钟上下，测定时间没有余 地，当样品浓度高或试剂质量下降时，均可致测定结果偏低。因此， 终点法不宜采用标明反应时间接近和长于仪器最大反应时间的试剂盒。 否则，必须用接近测定范围上限的高浓度质控血清监测。 2监测时间(读数点)和读数间隔时间各类型仪器不尽一致。离心式生 化仪读数间隔时间短，监测时间也短。流动式生化仪读数间隔时间一 般较长。分立式生化仪一般监测时间 10 分钟左右，间隔 10-30 秒读数 一次。有的仪器在整个测定反应周期全程读数，有的只读 取指定时间 (点)的吸光度。 3加试剂点采用双试剂时，加 R2 点决定 R1 与 样品的反应时间，也决定 R2 与 R1 及样品的反应时间。一般仪器各 5 分钟左右。HI TACHI 7170 有 4 个加试剂点，若采用双试剂，各 5 分钟， 则加 R2 设在第 3 加试剂点。 4反应监测时间还要考虑延迟时间的长 短、测定物质的浓度范围及相关临床价值和工作效率等因素。 二、延 迟时间 延迟时间(Delay Time)指试剂与样品混合后到监测开始之间的 时间。一般用于两点法和速率法，某些情况下也用于终点法。终点法 应选择反应趋于平 衡的时间(稳定期或平衡期)作测定，测定点前即所 谓的孵育期。速率法的线性反应期之前即延迟期。正确选择延迟时间 的长短，有利于准确测定，减少试验误差。设置一般根据试剂盒的说 明书，还应考虑本室的仪器特点和工作程序。 1仪器特点 比如，半自动生化仪多为流动比色池，要考虑泵速、进 样管长短、反应液黏稠度及混合情况，以及室温、反应液温度同反应 要求温度间的温差等。全自动生化仪的测定读数设置方式不同，直接 以“秒”设置，或以测定点设置、测定点间隔时间不一样，需要灵活 掌握。 2试剂及方法学 (1)试剂组成在酶活性的连续监测法时，若 试剂含工具酶数量多、偶联反应多，则激活反应时间一般较长，延迟 时间也较长，如肌酸激酶(NAC 法)延迟时间常设置 120-180 秒；若试剂 中底物经待测酶催化，其产物可以直接测定的，则延迟时间较短，如 -谷氨酰转移酶(GGT)设定 30-60 秒。同一项目同一方法，但试剂配方 不同，其反应快慢等特征也可能不同，如白蛋白测定。白蛋白与溴甲 酚绿(BCG)为即时反应，10 秒钟内已完成，其后球蛋白等也将与 BCG 发 生反应，所以孵育时间不能延长。但在同一测 定时间，BcG 浓度、缓 冲液种类、pH 和表面活性剂不 J 司的试剂，测定结果可能差异明显。 (2)样品异常成分干扰有的试验项目需要用工具酶将内源性代谢产物耗 尽，比如丙氨酸氨基转移酶活性测定试剂中须有足量的乳酸脱氢酶 (LDH)。如果使用单试剂，正常血清样品延迟时间 60 秒即可；但当内 源性酮酸增多(如酮症酸中毒)时，试剂内 LDH 常常不能 在 60 秒内完 全将其清除，剩余酮酸会进入监测期干扰测定，使测定结果偏高，所 以延迟时间应增至 90120 秒。采用双试剂，则可在加入 R1 后即进入 预孵育期。 (3)方法学要求比如肌酐(Jaffe 法)测定的特异性不强，一 般认为反应前 20 秒左右为乙酰乙酸等快反应干扰物呈色，后约 80 100 秒为蛋白质等慢反应假肌酐呈色，2060 秒肌酐呈色反应占主导 地位。采用两点法或速率法可减少干扰，但具体取多长的延 迟时间， 应根据试剂和仪器读数特点，以干扰试验等方法来评价决定。 3.工作程序 要在保证准确性的前提下，合理设置参数，提高工作效 率。最突出的例子是半自动生化仪上酶活性连续监测法的延迟时间设 定。由于只能单份样品逐一测定，若延迟时问全部设置在仪器内，每 个延迟时间加监测时间至少 1 分钟以上，守候时间较长。工作量大时， 可以根据仪 器控温、加样及读数和试剂特点，以及室温情况，将延迟 时问挪一部分到机外，套式操作，但要确保机内延迟时间不要进入线 性反应期。 4要兼顾延迟时间和监测时间反应时间是有限制的。在速率法和两点 法中，延长延迟时间必然缩短线性监测期，减少测定的线性范围，也 易发生底物耗尽。 三、样品量、试剂量与稀释量 有关参数包括样品 量、试剂量、稀释水量、最小反应体积和最大比色杯容量等。如 HITACHI7170 反应体积 180380l，最大体积 570 l。BT 224 半自 动生化仪流动比色池容积 33l，吸液量 200990l，最适体积 500l。 1最小反应体积 在仪器光度读数要用于结果计算时，反 应液液面高度不低于光度计光径的最小体积。它保证仪器的正确读数 和计算，也是仪器测定精度和经济性的指针之一。在有的仪器中，它 以反应体积的下限表示，有的则专门标明最小反应体积。在单试剂测 定中，样品与试剂的总体积不 得少于此参数。在双试剂测定中，若 R1 与样品的反应读数不纳入结果计算。R1 自勺加液量可不考虑此参数， 如连续监测法；否则应考虑它对结果的影响，如终点法在加 R2 之前读 数，并以此来扣除试剂或样品空白时。 在半自动生化仪中，最适吸人量相当于最少反应体积。它与进液管道 长度、流动比色池容积，吸液泵抽吸力大小和液体黏稠度有关，它要 保证光度检测不受空泡和前后样品携带污染的干扰。因此，吸人体积 不能任意降低，必要时，应加大反应液量和吸人量。 2最大比色杯容量 这个参数含义明确。在有的仪器中，它以反应 体积的上限表示，有的则专门标明最大比色杯容量。反应液超过此体 积，将致液体外溢，仪器测定系统被污损。 3样品试剂比例样品与 试剂的比例(SV：RV)，也可表示为样品体积分数 样品体积与反应 液总体积的比值(SVTV)，是方法学基本参数。酶活力测定中，样品 在总体积中的比例应在 10以下。一般来说 ，待测物质在样品中含量 低的、生理波动范围大的，样品用量较大。如 Trinder 反应测定血清 葡萄糖、胆固醇等，样品试剂比例多为 1：1OO，测定血尿酸或高密度 脂蛋白胆固醇，常增加为 1：50；ALT 和 AST 的样品试剂比例多为 1：1O 至 1：20。方法 灵敏、吸光度高的实验方法，样品试剂比例小, 如白蛋白 BCG 法，样品试剂比例常为 1：200。肌酐 Jaffe 氏法监测时 间短、吸光度值较低，样品试剂比例多为 1：10。一般应以试剂说明为 准，不宜轻易改动。 (1)改动样品试剂比例，影响一系列方法学参数。若比例增大，则线性 范围缩小，线性反应时间缩短，样品内源性干扰、基质效应增加、旁 路反应会增强，方法特异性也下降。若比例减少，检测信号偏低，信 噪比(噪音信号)增大，当仪器精度不高时，会加大测量误差 。 (2) 改动样品试剂比例，对某些反应有影响。如碱性磷酸酶(AI_P)，有文 献报道：当样品试剂比例从 1：25 降至 1：50 时，酶活力测定值增加， 再低于 1：50 时不再增加。这一效应可能是较高稀释度下 AIJP 多聚体 解聚的结果。体液样品稀释也可能对测定 结果产生影响：大多数蛋 白质在浓溶液中的分子构象比稀溶液中稳定，样品稀释可影响酶的稳 定性。(2)降低样品中内源性抑制剂或激动剂的浓度，如以蒸馏水稀释 血清，可能因降低血清中淀粉酶的激动剂氯离子的浓度，致测定淀粉 酶结果偏低；随血清稀释倍数增加， 肌酸激酶测定活力增加，可能与 降低样品中 AMt， 、胱氨酸等内源性抑制剂有关。 (3)双试剂时要兼顾 R1、R2 和样品三者的比例，尤其不宜改动试剂间 的比例。R2 要考虑仪器规定的加液最小体积，同一试剂瓶死体积下分 液量小而浪费大的经济问题等。 4稀释(水)量在加样或加试剂时， 加入去离子水或可以指定的液体。它的主要用途有两个。一是用于浓 缩试剂的稀释，或样品、校准品的稀释。二是在样品加量小的时候用 来冲洗样品探针，减小携带误差；但用量不宜太多，以免稀释试剂影 响反应。要把稀释水量纳入样 品试剂比例和反应液总体积考虑。必要 时，干粉试剂复溶也要考虑此因素。 四、试剂空白(Reagent blank)监测参数 无样品或以水代替样品在反 应过程中观察试剂空白值或其变化情况，主要用于监测试剂质量及仪 器稳定性，利用试剂空白对试剂本身或反应漂移引起的误差进行补偿， 用以校正A 或A/min。它与测定波长、光径大小、不同试剂及配方 和样品试剂比例等有关，不能盲 目套用，必要时宜实际测定。 1试 剂吸光度上限和下限定点监测试剂的吸光度。它常用规定波长及光径 下的吸光度值表示。仪器的试剂空白检测点因仪器和测定方法的不同 而有差异。终点法常在 PO 点读数，连续监测法常以反应监测起始点来 判读。仪器在试剂空白检测及相关的校准测定时，若监测到 超过此参 数的限值，则提示试剂失效或校准无效。反应吸光度向上的试验取上 限值：如 Trinder 反应以酚或 2-羟-3，5-二氯苯磺酸等和 4-氨基安替 比林作用，生成红色色素，试剂有一定的自发氧化，其试剂一般要求 试剂吸光度上限0. 1-0. 4。以结合型硝基苯衍生物作为底物的 ALP 和 GGT 常要求0.60.8。反应吸光度向下的试验取下限值：如以 NADH 或 NA DPH 为辅酶的 ALT 和 Urea(紫外法)等试验，一般要求试剂吸光度 下限10。 2试剂空白速率顾名思义，它是在反应过程中对试剂空白的变化速率 作连续监测，其数值在样品测定结果中自动扣除。试剂中可能混有的 其他杂酶或干扰物对试剂空白速率有影响。在酶促反应中，试剂空白 速率也是试剂在监测过程中底物自发降解的结果。底物为还原型辅 酶 者，本身不稳定而分解，多呈下降趋势；以硝基苯酚或苯胺的衍生物 作底物，在碱性环境中自发水解成被测物质，多呈上升趋势。此参数 主要用于连续监测法。一般认为酶活性测定的试剂空白速率(A/min) 应0. 0010.003。由于试剂空白速率与仪器检测下限、正常参考范 围下限等指标有关，有时也以浓度单位表示。要根据 K 值、仪器稳定 性、方法允许变异而定。例如，ALT 或 AST40U/L 以下活力浓度的分析 误差应10，其试剂空白速率应40UL。 一些仪器的程序参数 中没有此参数，但我们应在试剂空白的测定资料中关注它，若资料波 动大，须查找试剂或仪器原因。 3试剂空白的日常监测测定方法设置了试剂空白的项目，都要先行作 试剂空白测定，在样品测定计算中自动扣除。由于试剂空白不是在每 一个样品测定中实时测定并扣除，当样品测定中试剂的变化在未达到 参数设置限值时不易发现，试剂空白扣除会产生误差。所以，应根 据 试剂的稳定性确定试剂空白及相关的校准的测定频率。连续监测法的 试剂应每天(尤其在换另瓶或另批号试剂时)常规测定此参数。对样品 的异常结果也应及时对其测定吸光度资料(包括与试剂空白有关的资 料，例如 PO 点读数)观察分析。 4.有的半自动生化仪没有试剂吸光度上限和下限设定，但一般在测定 屏幕都显示初始吸光度值，应人工加以判断。酶活力测定结果呈负值， 有时可能与试剂空白错误有关。 5试剂吸光度上限和下限不是试剂 质量的唯一指针。因此，一定的校准频率和室内质控是质量保证的必 需手段。我们在实际工作中就遇到酶活力测定的试剂空白数据在规定 限值内，但质控物测定结果连续偏低，病人结果因每天标本少而难以 判断，最后发现是试剂质量下降 。 五、波长的选择及测定模式 波长 （Wave 1ength)的正确选择有利于提高测定的灵敏度和减少测定误差。 光度学方法有单波长和双波长之分，有的仪器可用三波长、甚至多 波 长，以及两波长比率等。有的仪器可作导数光谱分析。单波长测定易 受样品溶血、黄疸、脂浊等因素干扰。双波长测定可以通过副波长加 以修正，减少甚至消除干扰因素，提高测定准确性。采用同光束双波 长，亦有利于排除光源强度变化对结果的影响。 1测定波长选择有三个主要条件： (1)待测物质在该波长下的光吸收 最大。 (2)其吸收峰宜较宽而钝，而不是处于尖峰或陡肩，一般不选 光谱中的末端吸收峰，换句话说，该吸收峰处的吸光度随波长变化较 小。 (3)常见干扰物在该波长下的光吸收最小。试剂盒说明一般已提 供波长参数。实际波长选择需要了解待测物质和干扰组分对不同波长 单色光的吸收程度，即以波长为横坐标、吸光度为纵坐标作吸收光谱 曲线(光吸收曲线)。 采用透射免疫比浊法，免疫复合物大小约 35100mn 之间，于波长 290410nm 下有最大吸收峰，常取 340nm；如用胶乳增强免疫浊度法， 理想的检测波长可增至可见光区。 2双波长测定当待测物质与干扰 组分的吸收光谱互相重叠、出现非特异光吸收，或因反应液混浊出现 光散射时，可以采用双波长(或多波长)测定。双波长测定的原则是根