第三章 血液分析仪检验

第三章 血液分析仪检验 通过本章节学习，你将能回答关于“血液分析仪检验”的下列问题： 1自动血液分析仪在哪一年代问世？在临床检测中有何强劲优势？ 2现代血液分析仪具有检测哪几类血细胞的功能？ 3简述三分群血液分析仪细胞检测的主要原理？ 4射频电导法可检测细胞的哪些特征？ 5什么是流式细胞术 Mie 光散射理论？ 6简述流式细胞术检测细胞的主要原理？ 7简述激光散射法系统的基本组成？ 8血液分析仪应用分光光度法何种原理、检测何种物质？ 9血液分析仪应用哪两大类溶血剂检测血红蛋白？各有何特点？ 10血液分析仪检测白细胞应用哪些原理？试列举尽可能多的检测参数？ 11血液分析仪检测红细胞应用哪些原理？试列举尽可能多的检测参数？ 12血液分析仪检测血小板应用哪些原理？试列举尽可能多的检测参数？ 13什么是 VCS？检测血细胞各具有何特点？ 14血液分析仪检测白细胞分类、网织红细胞、有核红细胞、网织血小板分别用哪些特殊细胞染色法？ 15什么是 MAPSS？检测血细胞具有何特点？ 16什么是 DHSS？检测血细胞具有何特点？ 17血液分析仪检测红细胞计数、血小板计数分别应用哪些原理？ 18血液分析仪有哪几类结果显示形式？ 19简述三分群血液分析仪白细胞、红细胞和血小板直方图的表达特点？ 20哪些因素可影响正常细胞直方图？ 21简述五分类血液分析仪散点图上任意一点的表达特点？ 22红细胞体积血红蛋白九分区散点图有何特点？ 23什么是血液分析仪的报警概念？常见哪些报警方式和内容？ 24标本中哪些因素可引起血液分析仪检测参数报警（分检测参数举例）？ 25国际上有哪些重要文件涉及血液分析仪质量保证、仪器校准和性能评价？ 26血液分析仪质量保证包括哪些环节？ 27血液分析仪仪器校准有哪些要点？ 28血液分析仪性能评价有哪些要点和具体评价项目？ 29血液分析仪白细胞分类计数性能评价对标本来源有何要求？ 302005年，国际血液学组织发布的血液分析仪显微镜复检规则有几条？ 31用什么原则和指标评价血液分析仪检测参数的临床应用价值？ 32简述红细胞参数 RDW、IRF、CHr 临床意义？ 33简述血小板参数 MPV、IPF 临床意义？ 34简述白细胞参数 MID、IG、HPC、MPXI 临床意义？ 自动血液分析仪（automated hematology analyzer，AHA） ，早年称血细胞计数仪（blood cell counter），已是目前国内外临床检验最常用的筛检仪器之一。传统手工法显微镜血细胞计数或分类方法， 不仅速度慢，而且因操作过程的随机误差、实验器材的系统误差和检测方法的固有误差，检测的精密度不 高。在应对检查大量临床标本时，显微镜细胞计数法难以满足临床及时诊断疾病的需求。20世纪50年代初， 美国 W.H.Coulter 申请了粒子计数法的技术专利，在世界上研发了第1台电子血细胞计数仪，并应用于临 床，开创了血细胞计数的新纪元。从此，随着基础医学和高科技，特别是计算机软件技术的发展，其检测 原理逐渐完善，检测技术不断创新，检测参数显著增多。 “精度高、速度快、易操作、功能强”是血液分 析仪的强劲优势，还可与血涂片制备和染色仪进行组合，由后者完成血液分析仪检测后的形态学复检。现 代血液分析仪的功能还扩展到检测体液红细胞、白细胞计数和分类。当前，应用多项检测原理的血液分析 仪问世，为临床不同层次需求提供了有效的血细胞检测参数，对疾病诊断与治疗有着重要的临床意义。 现代血液分析仪的功能有：全血细胞计数功能（红细胞、白细胞和血小板计数及其相关的计算参数） 。白细胞分类功能（3分群或5分类白细胞百分率和绝对值） 。血细胞计数和分类功能的扩展功能，包 括：有核红细胞计数、网织红细胞计数及其相关参数检测；未成熟粒细胞、幼稚粒细胞、造血干细胞计数； 未成熟血小板比率；淋巴细胞亚型计数；细胞免疫表型检测等。 第一节 检测原理 现代血液分析仪主要综合应用了电学和光学2大原理，用以测定血液有形成分（细胞）和无形成分 （血红蛋白） 。电学检测原理包括电阻抗法和射频电导法；光学检测原理包括激光散射法和分光光度法。 激光散射法检测的对象有2类：染色的和非染色的细胞核、颗粒等成分。 一、电阻抗法 （一）血细胞计数原理 悬浮在电解质溶液中的血细胞相对于电解质溶液为非导电颗粒，其电阻比电解质溶液大。利用两者导 电性能的差异，当体积大小不同的血细胞（或类似颗粒）通过计数小孔时，可引起小孔内、外电流或电压 的变化，形成与血细胞数量相当、体积大小相应的脉冲电压，从而间接区分出血细胞群，并分别进行计数， 这就是电阻抗原理（principle of electrical impedance） ，即库尔特原理（Coulter principle） （图3- 1） 。 图3-1 电阻抗细胞计数原理 电阻抗法可准确测量出细胞（或类似颗粒）的大小，是三分群血液分析仪的主要应用原理。电阻抗法 还与光学检测原理组合应用于五分类血液分析仪中。 （二）三分群血液分析仪基本组成 三分群血液分析仪基本组成见表3-1。 表3-1 三分群血液分析仪基本组成 组成功能 信号发生器各种微粒（血细胞、细胞碎片、杂质等颗粒）通过检测小孔产生电阻抗脉冲信号的检测 源 放大器将血细胞微弱脉冲信号放大以触发电路系统 阈值调节器调节能区分不同群细胞合适的信号电平 甄别器去除非参考电平的各种假信号以提高计数的准确性 整形器将不一致的脉冲波形信号调整为标准的波形后触发计数电路系统 计数系统将整形后的血细胞脉冲信号显示为不同类群的细胞数 二、射频电导法 射频（radio frequency，RF）指射频电流，是每秒变化大于10 000次的高频交流电磁波。电导性 （electrical conductivity）即电的传送性能。高频电流能通过细胞壁。用高频电磁探针渗入细胞膜脂 质层可测定细胞的导电性，提供细胞内部化学成分、细胞核和细胞质（如比例） 、颗粒成分（如大小和密 度）等特征性信息（图3-2） 。电导性特别有助于鉴别体积虽相同、但内部结构性质不同的细胞（或相似体 积的颗粒） ；如淋巴细胞和嗜碱性粒细胞两者直径虽均为912m，但在高频电流检测时，因两类细胞不 同核质比例而出现不同的检测信号。射频电导法结合其他检测原理一起应用于血液分析仪中。 图3-2射频电流检测原理 三、激光散射法 （一）基本检测原理 激光散射法应用了流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测原理。 1流式细胞术光散射理论 目前，细胞分析应用 Mie 同质性球体光散射理论（Mie theory of light scatter for homogenenous spheres） 。即：当光散射符合“2/D10/” （，入射光波长； D，球形物体直径）时，则测定光照射在颗粒上所形成的光散射强度的公式是： S（，） 其中，S：散射光强度；：使用波长；：折射率；：容积；：检测角度；：形状因子。 2流式细胞术检测原理 将经试剂稀释、染色、球形化的细胞（或其他颗粒）悬液注入鞘液流中央， 单个细胞随悬液和鞘液流两股液流整齐排列，以恒定流速定向通过石英毛细管（图3-3） 。当细胞（或其他 颗粒）通过激光束被照射时，细胞（或其他颗粒）因本身的各种特性（如体积大小、染色程度、细胞成分 浓度或细胞核密度等） ，可阻挡或改变激光束的方向，产生与细胞（或其他颗粒）特征相应的各种角度的 散射光。置放在石英毛细管周围不同角度的信号检测器（光电倍增管）接受到特征各异的散射光。来自低 角度散射光（或称前向散射光）的信息，反映细胞（或其他颗粒）的数量和表面体积大小；来自高角度散 射光（或称侧向散射光）的信息，反映细胞（或其他颗粒）的内部颗粒、细胞核等复杂性。如细胞（或其 他颗粒）用荧光染料染色，则染色后的细胞（或其他颗粒）被激光照射时，可产生不同波长的荧光散射， 可用检测器接受散射荧光（图3-4） 。将来自各种散射光的信息进行综合分析，即可准确区分正常类型的细 胞（或其他颗粒） 。激光散射法在区别体积相同而类型不同的细胞特征时，比电阻抗法血细胞分群更准确。 故激光散射法已成为现代五分类血液分析仪的主要检测原理之一。 图3-3鞘流技术 （二）激光散射法系统基本组成 激光散射法系统基本组成见表3-2，图3-4。 表3-2 激光散射法系统基本组成 名称组成及评价 光源气体（氦-氖、氩气等）激光或固体（半导体）激光（单色光） ；钨光源（多色光） 鞘流维持颗粒于液流中央，顺序、单个、恒速向前流动，即流体动力学聚焦（hydrodynamic focusing） 细胞悬液被检测细胞（颗粒）的悬液，由气压导入流动池 光检测器接受来自各种角度的散射光或吸收光信号，并转换成相应特征的电信号 图3-4流式细胞术检测通道和光路系统 四、分光光度法 分光光度法检测原理遵循 Lambert-Beer 比色定律，即A= lg（I0/I） 。其中，A 是吸光度 （absorbance） ，或称光密度（optical density，D） ；I0是单色入射光强度，I 为透过光强度。被检物质 吸收的单色光量与有色溶液（或悬液）的性质、厚度和浓度有关。当液体性质和厚度固定后，则吸光度与 液体物质浓度成正比。 分光光度法仪器的主要组成：单色光源、检测池和比色容器、光检测器。 三分群或五分类血液分析仪均用分光光度法原理测定血红蛋白：含有溶血剂的稀释液使红细胞溶解并释放 出血红蛋白，血红蛋白与溶血剂中某些成分结合，形成一种稳定的血红蛋白衍生物，在特定的光波范围 （530550nm）下进行比色；吸光度的变化与血液血红蛋白浓度成正比。 目前，用于血红蛋白测定的溶血剂有2大类。一类是含氰化物的溶血剂，所形成氰化血红蛋白（HiCN） ， 最大吸收峰在540nm，显色稳定。另一类是不含氰化物的溶血剂，如月桂酰硫酸钠血红蛋白（sodium lauryl sulfate，SLS）法，当用 HiCN 法校准后，其检测的优点是既可达到与 HiCN 法相当的精密度和准 确性，又可避免 HiCN 法试剂对操作人员的潜在危害和对环境的污染。 五、血液分析仪检测参数原理 （一）血液分析仪检测参数原理 不同类型血液分析仪检验参数的原理不尽相同。高档仪器应用2种或2种以上检测原理，组合电学、光 学、细胞化学等技术，在独特检测通道测定红细胞、血小板和白细胞系列的数量、亚类及相关参数（表3- 3、表3-4） 。 表3-3 血液分析仪临床常用检验参数基本原理和技术白细胞系列 检测参数英文全称缩写单 位 检测原理和技术 白细胞计数 white blood cell count/concentration WBC1 09/ 光散射（或加荧光染色）（五分类） ；电阻抗法（三分群，五分类） L 中性粒细胞 计数 neutrophil count/absolute concentration NEUT#1 09/ L 淋巴细胞计 数 lymphocyte count/absolute concentration LYMPH # 1 09/ L 光散射（或加荧光染色，或加细胞 化学法）、射频法、鞘流电阻抗法、 光吸收法（五分类）；电阻抗法 （三分群） 单核细胞计 数 monocyte count/absolute concentration MONO#1 09/ L 嗜酸性细胞 计数 eosinophil count/absolute concentration EO#1 09/ L 嗜碱性细胞 计数 basophil count/absolute concentration BASO#1 09/ L 光散射（或加荧光染色，或加细胞 化学法）、射频法、鞘流电阻抗法 （五分类）、光吸收法（五分类） 中间细胞群 计数 middle cell countMID#1 09/ L 电阻抗法（三分群） 中间细胞群 百分率 middle cell percentMID% 来自计算（三分群） 粒细胞群计 数 granulocyte countGRAN#1 09/ L 电阻抗法（三分群） 粒细胞群百 分率 granulocytepercentGRAN% 来自计算（三分群） 淋巴细胞群 计数 lymphocyte countLYM#1 09/ L 电阻抗法（三分群） 淋巴细胞群 百分率 lymphocyte countLYM% 来自计算（三分群） 淋巴细胞百 分率 lymphocyte percentage of WBCsLYMPH % % 来自计算（五分类、三分群） 单核细胞百 分率 monocyte percentage of WBCsMONO% 来自计算（五分类） 嗜酸粒细胞 百分率 eosinophil percentage of WBCsE0% 来自计算（五分类） 嗜碱粒细胞 百分率 basophil percentage of WBCsBAS0% 来自计算（五分类） 未成熟粒细 胞计数 immature granulocyte absolute count IG#， IMG% 1 09/ L 射频法和电阻抗法、光吸收法（五 分类） 续表3-3 血液分析仪临床常用检验参数基本原理和技术白细胞系列 检测参数英文全称缩 写 单 位 检测原理和技术 未成熟粒细 胞百分率 immature granulocyte percentIG% ，I MG% % 来自计算（五分类） 造血祖细胞 百分率 hematopoietic progenitor cell percentage HPC % % 来自计算（五分类） 造血祖细胞 计数 hematopoietic progenitor cell absolute count HPC # 1 09/L 射频法和电阻抗法（五分类） 大型未染色 细胞计数 large unstained cell countLUC # 1 09/L 光散射法（加细胞化学染色） （五分类） 大型未染色 细胞百分率 large unstained cell percentageLUC % % 来自计算（五分类） CD3 T 细胞 absolute number of T-CD31 光散射（加免疫单克隆抗体荧光 计数cells（CD3lymphocytes） T09/L 染色）（五分类） CD4 T 细胞 计数 absolute number of T- helper/inducer cells（CD3CD4lymphocytes） CD4 T 1 09/L 光散射（加免疫单克隆抗体荧光 染色）（五分类） CD8 T 细胞 计数 absolute number of T- suppressor/cytotoxic cells（CD3CD8lymphocytes） CD8 T 1 09/L 光散射（加免疫单克隆抗体荧光 染色）（五分类） CD3 T 细胞 百分率 percentage of lymphocytes that are T-cells（CD3lymphocytes） CD3 % % 来自计算（五分类） CD4 T 细胞 百分率 percentage of lymphocytes that are T-helper/inducer cells （CD3CD4lymphocytes） CD4 % % 来自计算（五分类） CD8 T 细胞 百分率 percentage of lymphocytes that are T-suppressor/cytotoxic cells（CD3CD8lymphocytes） CD8 % % 来自计算（五分类） CD4/ CD8 T 细胞比率 ratio of T-helper/inducer cells to T-suppressor/cytotoxic cells（ratio of CD3CD4lymphocytes to CD3CD8lymphocytes） 4/8 来自计算（五分类） 续表3-4 血液分析仪临床常用检验参数基本原理和技术红细胞和血小板细胞系列 检测参数英文全称缩 写 单 位 检测原理和技术 红细胞计数 red blood cell concentration RBC1 012 /L 鞘流电阻抗法（五分类），电 阻抗法（三分群） 血红蛋白浓度 hemoglobin concentrationHGBg/L 氰化活非氰化高铁血红蛋白比 色法（三分群，五分类） 血细胞比容 hematocritHCT% 来自计算（三分群，五分类） 平均红细胞体积 mean cell/corpuscular volume MCVfl 鞘流电阻抗法（五分类），电 阻抗法（三分群） 平均血红蛋白量 mean cell/corpuscular hemoglobin MCHpg 来自 HGB/RBC 计算（三分群， 五分类） 平均血红蛋白浓度 mean cell/corpuscular hemoglobin concentration MCH C g/L 来自 HGB/ HCT 计算（三分群， 五分类） 有核红细胞计数 nucleated red blood cell absolute concentration NRB C# 1 09/ L 光散射（或加核酸荧光染色） （五分类） 有核红细胞百分率 nucleated red blood cell percentage of NRB C% % 来自计算（五分类） 红细胞分布宽度-s值 red cell volume distribution width-S RDW -s fl 来自计算（五分类，三分群） 红细胞分布宽度-CV 值 red cell volume distribution width-CV RDW -CV % 来自计算（五分类，三分群） 球形细胞平均体积 mean sphered cell volumeMSC V fl 光散射、射频法、鞘流电阻抗 法（五分类） 单个红细胞平均血红蛋白 量 corpuscular hemoglobin content CHpg 光散射法（五分类） 单个红细胞平均血红蛋白 浓度 corpuscular hemoglobin concentration mean CHC M g/L 光散射法（五分类） 红细胞血红蛋白量分布宽 度 hemoglobin concentration distribution width HDWg/L 来自计算（五分类） 全部网织红细胞和成熟红 细胞平均体积 mean corpuscular volume of reticulocytes of all gated red cells MCV g# fl 光散射法（加核酸荧光染色） （五分类） 全部网织红细胞和成熟红 细胞平均血红蛋白浓度 corpuscular hemoglobin concentration mean of CHC Mg# g/L 光散射法（加核酸荧光染色） （五分类） all gated red cells 续表3-4 血液分析仪临床常用检验参数基本原理和技术-红细胞和血小板细胞系列 检测参数英文全称缩 写 单 位 检测原理和技术 全部网织红细胞和成熟红 细胞平均血红蛋白量 mean hemoglobin content of reticulocytes of all gated red cells CHg # pg 光散射法（加核酸荧光染色） （五分类） 网织红细胞血红蛋白浓度 分布宽度 reticulocyte cellular hemoglobin concentration distribution width HDW r g/L 来自计算（五分类） 网织红细胞平均血红蛋白 浓度 corpuscular hemoglobin concentration mean of reticulocytes CHC Mr g/L 光散射法（加核酸荧光染色） （五分类） 网织红细胞血红蛋白量 reticulocyte hemoglobin equivalent RET -He pg 来自光散射（加荧光核酸染色） 网织红细胞计数（五分类） 网织红细胞平均血红蛋白 量 mean hemoglobin content of reticulocytes CHrpg 光散射法（加核酸荧光染色） （五分类） 网织红细胞计数 reticulocyte countRET # 1 09/ L 光散射（加核酸荧光染色） （五分类） 网织红细胞百分率 reticulocyte count percentage RET % % 来自计算（五分类） 未成熟网织红细胞比率 immature reticulocyte fraction IRF% 来自计算（五分类） 低荧光强度网织红细胞比 率 low fluorescence ratioLFR% 来自计算（五分类） 中荧光强度网织红细胞比 率 middle fluorescence ratio MFR% 来自计算（五分类） 高荧光强度网织红细胞比 high fluorescence ratioHFR% 来自计算（五分类） 率 低吸光度网织红细胞百分 率 low absorption reticulocytes percent %L RET % 来自计算（五分类） 中吸光度网织红细胞百分 率 medium absorption reticulocytes percent %M RET % 来自计算（五分类） 高吸收光网织红细胞百分 率 high absorption reticulocytes percent %H RET % 来自计算（五分类） 低荧光网织红细胞百分率 low fluorescence reticulocytes percent RET L% % 来自计算（五分类） 续表3-4 血液分析仪临床常用检验参数基本原理和技术红细胞和血小板细胞系列 检测参数英文全称缩写单 位 检测原理和技术 中荧光网织红细胞百分率 medium fluorescence reticulocytes percent RETM% 来自计算（五分类） 高荧光网织红细胞百分率 high fluorescence reticulocytes percent RETH% 来自计算（五分类） 高散射光网织红细胞百分 率 high light scatter retic percent HLR% 来自计算（五分类） 高散射光网织红细胞计数 high light scatter retic count HLR#1 09/ L 光散射、射频法、鞘流电阻抗 法（加非荧光核酸染色）（五 分类） （网织红细胞）平均荧光 指数 mean fluorescence index MFI% 光散射法（加核酸荧光染色） （五分类） 网织红细胞平均体积 mean reticulocyte volume MRV，M CVr fl 光散射、射频法、鞘流电阻抗 法（加非荧光核酸染色）（五 分类） 血小板计数 Platelet concentration PLT1 09/ L 光散射（或加荧光染色，或加 单克隆抗体）（五分类）；鞘 流电阻抗法（五分类）；电阻 抗法（五分群） 未成熟血小板比率 immature platelet fraction IPF% 来自光散射法（加核酸荧光染 色）（五分类） 血小板分布宽度 platelet distribution width PDWCV （% ）， s（ fl ） 来自计算（五分类，三分群） 血小板平均体积 mean platelet volumeMPVfl 鞘流电阻抗法（五分类）；电 阻抗法（三分群） 大血小板比率 Platelet larger cell ratio P-LCR% 来自计算（五分类，三分群） 血小板比容 PlateletcritPCT% 来自计算（五分类，三分群） （二）白细胞系列参数检测原理 1体积、电导和光散射（volume，conductivity，light scatter，VCS）法（图3-5） VCS 技术， 通过一个检测通道，在细胞几近自然状态下，分别应用电阻抗技术检测细胞体积，电导（射频）技术检测 细胞大小和内部结构（包括细胞化学成分和核的体积） ，光散射技术（1070）检测细胞内的颗粒性、 核分叶性核细胞表面结构。3种技术相互协调，同时检测。经复杂计算，按散点定位分析出细胞类型、按 每一类型细胞数量计算出百分率、按散点密度检测出细胞亚类。 在 VCS 技术下，不同血细胞群的特征见表3-5。由于各种血细胞的特征不同，从而各种细胞在散点图 处于不同的部位而得以区别（图3-6 ） 。VCS 技术从正常细胞的数量、形态和密度可衍生出一整套报警形 式，提示存在幼稚细胞等异常，并按细胞系列可作出原始细胞报警，经显微镜检复查后报告临床。VCS 技 术检测病理性异常细胞的散点图位置见图3-7。 表3-5 VCS 技术下各血细胞群的特征 细胞群 特征 VCS 淋巴细胞群小低弱 单核细胞群相对较大相对低相对弱 中性粒细胞群与大淋巴或小单核细胞相似相对和较高相对和较强 嗜酸性粒细胞群与相似与相似相对较高 嗜碱性粒细胞群与相似相对淋巴细胞较高相对较强 图3-5 体积、电导和光散射法 图3-6 VCS 细胞检测立体散点图 A：旋转的3维散点图（图中有红细胞和白细胞分类图） ，可从任何角度观察。 B：3维散点图上的细胞群落可显示和隐藏（图中已隐藏淋巴细胞和中性粒细胞） 图3-7 VCS 异常细胞检测平面散点图位置 2流式细胞术、电阻抗、射频和特殊细胞染色法 检测通道：4DIFF 通道：利用激光流式细胞术、 核酸荧光染色技术，采用专一溶血剂溶解红细胞和血小板，而白细胞膜仅部分溶解出现小开口，核酸荧光 染料聚次甲基（polymethine）进入受损的白细胞内，与 DNA、RNA 和细胞器结合，使之着色。染色后白细 胞色深（未成熟粒细胞、异常细胞荧光染色更深，成熟白细胞荧光染色浅） ，红细胞不染色，血小板稍染 色。因荧光强度与细胞所含核酸量成比例，从而得到4DIFF 白细胞散点图（图3-8） ，包括中性粒细胞和嗜 碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞（百分率和细胞计数绝对值）和未成熟粒细胞（百分率 和细胞计数绝对值） 。WBC/BASO 通道（图3-9）：在碱性溶血剂作用下，除嗜碱性粒细胞外的其他所有 细胞均被溶解或萎缩，随后用流式细胞术计数嗜碱性粒细胞，从而得到 WBC/嗜碱性粒细胞百分率和细胞 计数绝对值及 WBC/BASO 散点图。未成熟粒细胞信息（immature myeloid information，IMI）通道（图 3-10）：用射频、电阻抗和细胞化学染色法。在细胞悬液中加硫化氨基酸，幼稚细胞与硫化氨基酸结合的 量多于较成熟的细胞、且对溶血剂有抵抗作用。因此，当加入溶血剂时，成熟细胞被溶解，只留下幼稚细 胞（含未成熟粒细胞、原始细胞、造血祖细胞）得以计数。IMI 通道可定量分析不同类型幼稚细胞，包括 造血祖细胞（hematopoietic progenitor cell，HPC） 、成熟粒细胞、原始细胞、异型/异常淋巴细胞、核 左移和有核红细胞，得到 HPC 百分率和绝对值计数。 图3-8 白细胞分类-4DIFF 散点图 图3-9白细胞分类-白细胞/嗜碱性粒细胞散点图 图3-10未成熟粒细胞信息通道散点图 3钨光源、激光散射法 过氧化物酶（peroxidase，Perox）染色通道（图3-11）：用钨光源散射 法、表面活性剂溶解红细胞、过氧化物酶染色。过氧化物酶活性强度：嗜酸性粒细胞大于中性粒细胞，后 者大于单核细胞；淋巴细胞和嗜碱性粒细胞则无过氧化物酶活性。测定过氧化物酶平均指数（mean peroxidase index，MPXI） ，得到嗜酸性粒细胞、中性粒细胞或单核细胞相对过氧化物酶活性，得到过氧 化物酶分布强度的散点图，作白细胞计数。嗜碱性粒细胞/核分叶性（baso/lobularity）通道（图3- 12）：固体激光通道，用含苯二酸（phthalic acid）和强酸性表面活性剂稀释液溶解红细胞和血小板， 除嗜碱性粒细胞外，其他所有白细胞膜均被破坏，胞质溢出，仅剩裸核，作白细胞计数和嗜碱性粒细胞计 数。完整的嗜碱性粒细胞呈高角度散射，位于散点图上部；裸核则位于下部。因不同细胞的裸核结构不同 （如淋巴细胞、幼稚细胞为圆形，中性粒细胞为分叶核） ，分叶越多散点越靠坐标横轴右侧；根据多分叶 核（polymorphonuclear，PMN）和单个核（mononuclear，MN）的比例，可计算出左移指数（left index，LI） 。LI 越强，说明左移程度越明显。结合嗜碱性粒细胞/分叶核通道结果可计算出白细胞总数和 分类计数结果。未染色大细胞（large unstained cell count，LUC）检测：在 Perox 通道，可检测到 大于正常淋巴细胞体积平均值2个标准差的细胞，如异型淋巴细胞、浆细胞、毛细胞、幼稚淋巴细胞和原 始细胞。 图3-11 白细胞（N、L、M、E）过氧化物酶染色散点图 图3-12 嗜碱性粒细胞/核分叶性散点图 4多角度偏振光散射法（multi angle polarized scatter separation，MAPSS） 应用固体激光流 式细胞荧光技术，多角度检测白细胞和分类。白细胞计数和分类：多散点图分析（multi scatterplot analysis，MSA），用含染 DNA 染料碘化丙啶（propidium iodide）试剂，可破坏有核红细胞膜和细胞质， 只留下细胞核，裸核易于染色。染料对活性白细胞只有极小渗透性或无渗透性，故不出现细胞核染色。鉴 别有核红细胞、非活性白细胞和脆性白细胞，计算活性白细胞比率。 MAPSS 法可鉴别白细胞亚群、异常细胞类型，白细胞分类不受有核红细胞、血小板凝聚、不溶解红细 胞和细胞碎片等干扰物质影响。血标本经鞘液稀释后，白细胞内部结构近似自然状态；血红蛋白从红细胞 内溢出，红细胞膜结构仍保持完整，而鞘流水分子则进入红细胞，此时红细胞折光系数与鞘液相当，不干 扰白细胞检测。多角度偏振光散射法分4个角度（图3-13）检测：0，前向散射光：反映细胞大小，同 时检测细胞数量（图3-14） 。7，侧向散射光：反映细胞内部结构及核染色质的复杂性。90，垂直 角度散射光（偏振光）：反映细胞内部颗粒及分叶状况（图3-15） 。90D，垂直角度消偏振散射光； “去偏振”是指垂直方向激光光波运动随光散射结果而改变；在光散射过程中，嗜酸性粒细胞颗粒丰富， 可去偏振光，与中性粒细胞鉴别（图3-16） 。 CD3/4/8免疫 T 淋巴细胞计数：应用 CD3/4和 CD3/8单克隆抗体荧光染色标记技术、光散射法检测（图 3-17，图3-18） 。 图3-13 多角度偏振光散射法（MAPSS）模式图 图3-14 0前向散射光反映细胞大小，同时检测细胞数量 7侧向散射光反映细胞内部结构及核染色质复杂性 图3-15 90垂直角度散射光（偏振光）：反映细胞内部颗粒及分叶状况 图3-16 90D 垂直角度消偏振散射光（去偏振光） 90垂直角度散射光（偏振光） 图3-17CD3/4免疫 T 淋巴细胞计数散点图 图3-18CD3/4/8免疫 T 淋巴细胞计数散点图 5双流体（双鞘流）动力连续系统（double hydrodynamic sequential system，DHSS） 用钨光源 流式细胞光吸收、化学染色和电阻抗法。白细胞计数通道：用电阻抗法检测。嗜碱性粒细胞通道：用 专用染液染色，嗜碱性粒细胞具有抗酸性，而其他细胞胞质溢出，成为裸核，用电阻抗法检测，所得结果 与白细胞/血红蛋白通道（采用鞘流阻抗法测定白细胞）的白细胞结果进行比较（图3-19） 。白细胞分类 通道：双鞘流系统中，用流式细胞光吸收、电阻抗和细胞化学染色液对细胞脂质和蛋白组分染色检测除各 类嗜碱性粒细胞以外的白细胞（图3-20） ；在幼稚红细胞通道，荧光染色，进行白细胞分类。 图3-19嗜碱性粒细胞计数直方图 图3-20 白细胞分类计数散点图 DHSS 技术：在流式通道中有2个鞘流装置，细胞经第1束鞘流后通过阻抗微孔测定细胞的真实体积， 然后经第2束鞘流后到达光窗，测定细胞的光吸收，分析细胞内部结构（图3-21） 。染色剂中含有溶血素及 氯唑黑 E（chlorazol black E）活体染料，溶解红细胞，对单核细胞初级颗粒、嗜酸性粒细胞和中性粒 细胞特异颗粒进行染色，同时对细胞膜、核膜、颗粒膜染色，得到中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、 淋巴细胞、异型淋巴细胞和巨大未成熟细胞（large immature cell，LIC）散点图结果。双矩阵 LIC 散点 图可将幼稚细胞分为3个亚群（图3-22）：未成熟粒细胞（immature granulocyte，IMG）：包括异常中 性粒细胞、晚幼粒细胞、中幼粒细胞、早幼粒细胞、原始粒细胞。未成熟单核细胞（immature monocyte，IMM）：包括早幼单核细胞、原始单核细胞。未成熟淋巴细胞（immature lymphocyte，IML）：包括早幼淋巴细胞、原始淋巴细胞等。 图3-21 双鞘流图 图3-22 双矩阵巨大未成熟细胞（LIC）散点图 （IMG 未成熟粒细胞、IMM 未成熟单核细胞、IML 未成熟淋巴细胞） （三）成熟红细胞系列参数检测原理 1电阻抗法 依据红细胞大小和数量进行红细胞计数（图3-23） 。 图3-23 正常红细胞直方图 2流式细胞术、鞘流电阻抗法 红细胞/血小板计数通道：当红细胞计数和血小板计数结果异常时， 可提示转换至 RET/PLT-O 光学检测通道，用光学法测定血小板（PLT-O） 。得到与红细胞计数和血小板计数 相关的众多参数（图3-24） 。 图3-24 光学法检测网织红细胞、成熟红细胞和血小板散点图 3流式细胞术激光散射法 （1）红细胞/血小板检测通道：用稀释液十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）使红细 胞/血小板成为球形并经戊二醛固定，红细胞被激光照射后，所得信号相同，且不影响 MCV 的测定。用低 角度光散射测量红细胞体积与总数，高角度光散射检测单个血红蛋白浓度，可准确测定 MCV、MCH、MCHC 值，得到红细胞散点图；同时可测定单个红细胞体积及红细胞内血红蛋白含量，得到相应直方图及 RDW、HDW 等参数。 （2）红细胞散点图：是红细胞体积与血红蛋白浓度二维散点图，反映光散射与细胞体积和血红蛋白 浓度之间的相互关系，能准确区分小红细胞等异常。在正常红细胞体积/血红蛋白浓度 （volume/hemoglobin concentration，V/HC）散点图中多数红细胞位于散点图中央，原始散点图为非线 性（图3-25） ，如用视觉评价则有困难。在线性 V/HC 的散点图中，X 轴表示红细胞中血红蛋白浓度（参考 值280410g/L） ，低于280g/L 为低色素红细胞，高于410g/L 为高色素红细胞；Y 轴表示红细胞体积（参 考值60120fl） ，小于60fl 为小红细胞，大于120fl 为大红细胞。报告参数有 RBC、MCV、RDW、单个红细 胞平均血红蛋白浓度（cell hemoglobin concentration mean，CHCM） 、血红蛋白分布宽度（hemoglobin distribution width，HDW） 、CH、HCT、MCH、MCHC（CHCM 是 RBC/HC 直方图的平均值，HDW 是 RBC/HC 直方 图的平均值的标准差） 。 线性散点图分为9个区（图3-26） ，有助于贫血的分类和诊断，欧洲已将其列入贫血和血透患者诊治指 南。如小红细胞低色素，用小细胞/低色素（microcytic cell，M）/（hypochromic cell，H）比值表示， 有助于区别 珠蛋白生成障碍性贫血和缺铁性贫血；小红细胞高色素可筛检球形红细胞性贫血。 图3-25 红细胞体积血红蛋白浓度原始散点图 图3-26线性化红细胞体积/ 血红蛋白浓度（V/HC）散点图 4电阻抗法和光散射法 用聚焦阻抗法（首次计数）和激光法（二次计数）分别测定红细胞数。在光 散射法计数血小板时，用2个角度（90、7）检测红细胞（图3-27） ，作为校准电阻抗法红细胞计数之 用。 图3-27光散射法血小板计数和红细胞计数散点图 （四）血小板系列参数检测原理 1电阻抗法 依据血小板大小和数量进行血小板计数。在电阻抗法血小板计数时，有的还采用3次计 数、扫流和拟合曲线等技术提高计数准确性（图3-28） 。 图3-28 电阻抗法正常血小板计数和拟合曲线直方图 2流式细胞激光核酸荧光染色和电阻抗法 红细胞/血小板计数通道：用鞘流电阻抗法测定血小板计 数（PLT-I）结果异常时，仪器转换至光学法核酸荧光染色网织红细胞/血小板检测通道，用光学法测定血 小板（PLT-O） 。核酸（DNA/RNA）荧光染色时，未成熟网织血小板染色多，成熟血小板染色少，并显示 PLT-O 散点图结果（图3-24） ，可得到未成熟网织血小板比率（immature platelet fraction，IPF） 、光 学法血小板计数（PLT-O） 、电阻抗法血小板计数（PLT-I） 、血小板比容（plateletcrit，PCT） 、血小板分 布宽度（platelet distribution width，PDW） 、血小板平均体积（mean platelet volume，MPV） 、大血 小板比率（platelet larger cell ratio，P-LCR） 。成熟红细胞无 DNA/RNA，不被染色，从而得以在体积 大小和核酸染色上与血小板鉴别。 3激光散射法 根据 Mie 同质性球体光散射理论，球形化血小板通过激光照射区时，在高角度 （515）得到血小板折射指数（refactive index，RI） ，此与血小板密度有关；低角度（23） 得到血小板大小。血小板的体积为130fl，RI 在1.351.40（图3-29，图3-30） 。红细胞含高浓度血红 蛋白，RI 较高在1.351.44。大血小板虽然可能与小红细胞、红细胞碎片、影红细胞（ghost）以及其他 细胞碎片体积相似，但因其内容物不同，RI 相差较大，在血小板二维散射图上可得以区别。在血小板散 点图上，大血小板折射率为1.31.40，体积大于20fl；在红细胞散点图上，红细胞折射率（1.351.40） ， 体积小于60fl。因此，二维激光散射法可区分血小板和红细胞。 图3-29 血小板体积和折射率光散点图 图3-30 血小板体积和折射率线性光散点图 4固体激光散射法、电阻抗法和单克隆抗体荧光染色散射法 用激光法（初次计数）和聚焦阻抗法 （二次计数）分别测定血小板数；在激光散射法，用2个角度（7和90）检测血小板（图3-31） ；用 CD61单克隆抗体免疫标记荧光染色光散射法主要用于阻抗法血小板计数的核查，可进一步验证血小板计数 的准确性（图3-32，图3-33） 。稀释液使血小板成为球形并经戊二醛固定，血小板被激光照射后，所得信 号相同，而且不影响 PCV 的测定。用电阻抗法测定血小板计数。在低浓度血小板时，CD61血小板计数更准 确，不受白细胞和红细胞碎片的影响。 图3-31 光散射法血小板计数散点图 图3-32 单克隆抗体 CD61荧光散射法血小板计数散点图 图3-33 单克隆抗体 CD61血小板检测正常直方图 （五）血红蛋白浓度测定检测原理 用光学比色原理测定血红蛋白浓度，有2类稀释液： 1改良氰化高铁血红蛋白法 测定波长540nm，稀释液含氰化物成分。 2非氰化高铁血红蛋白法 即稀释液不含氰化物配置的成分。如 SLS-Hb 测定法，测定波长555nm。与 手工法 HiCN 测定的相关性高（r=0.999） 。手工法 HiCN 反应时间长，仅用于仪器的校准。有些血液分析仪 测定血红蛋白，可兼用非氰化物试剂（如用二甲基月桂胺氧化物 dimethyl laurylamine oxide）和氰化 物试剂（如用咪唑 imidazole，含氰化物试剂作用，但无毒性） 。 （六）网织红细胞系列参数检测原理 用各种染色剂对网织红细胞 RNA 成分进行染色，增强了网织红细胞计数的精密度和准确性。染色剂有： 非荧光染料：新亚甲蓝（new methylene blue） 。荧光染料：噁嗪（oxazine） 、碱性槐黄 O（auramine O） 、聚次甲基、噻唑橙（thiazole orange） 、氧氮杂芑750（oxazine 750）等。 1非荧光染料染色法 用新亚甲蓝对网织红细胞 RNA 染色，同时用一种试剂使红细胞内血红蛋白溢出 后变为“影细胞” ，可减少对网织红细胞检测的干扰，采用 VCS 技术测定网织红细胞（图3-34） 。此外，还 应用柔变轮廓分析技术，以非线性方式区分网织红细胞群和成熟红细胞群。网织红细胞群分10个成熟度； RNA 最多的网织红细胞位于最强的光散射区（310区） 。散点图可得到网织红细胞参数：RET%、RET#、未 成熟网织红细胞（immature reticulocyte fraction，IRF） 、网织平均红细胞体积（mean reticulocyte volume，MRV，MCVr） 、平均球形细胞体积（mean sphered cell volume，MSCV） 、网织红细胞成熟指数 （reticulocyte maturity index，RMI） 、高散射光网织红细胞（high Light scatter retic，HLR） 、网 织红细胞分布宽度（reticulocyte distribution width，RDWr） 。 图3-34 VCS 原理新亚甲蓝染色网织红细胞测定散点图 2荧光染料染色法 （1）用聚次甲基染 RNA 和噁嗪染 DNA 法：在光学法网织红细胞/血小板计数通道，因白细胞所含 DNA 量远大于网织红细胞所含 RNA 量，白细胞荧光强度远超出网织红细胞的荧光范围，网织红细胞的荧光强度 高于成熟红细胞，故可对成熟红细胞、网织红细胞、血小板和白细胞进行区别（图3-24） 。半导体激光流 式细胞术、散点图可得到 RET#/%、高荧光强度网织红细胞比率（high fluorescence ratio，HFR）、中 荧光强度网织红细胞比率（middle fluorescence ratio，MFR） 、低荧光强度网织红细胞比率（low fluorescence ratio，LFR） 、网织红细胞血红蛋白量（reticulocyte hemoglobin equivalent，RET-He）、 未成熟网织红细胞比例IRF=（MFR+HFR）/（MFR+HFR+LFR）和 PLT-O 等参数。 （2）用氧氮杂芑750染