自体干细胞移植治疗下肢缺血的规范化方案 ---专家共识

自体干细胞移植治疗下肢缺血的规范化方案自体干细胞移植治疗下肢缺血的规范化方案 -专家共识专家共识 导言：干细胞作为一种新兴的生物疗法，越来越广泛的应用于治疗传统医学方法难以治疗 的多种顽症，临床应用潜力巨大。目前全球已经批准了八项干细胞治疗技术，分别用于退 行性关节炎和膝关节软骨损伤修复、急性心梗、移植抗宿主反应（GvHD）、克隆氏病并发 肛瘘、遗传性或获得性造血系统疾病，另外有超过100多种疾病正处于临床试验阶段，临 床应用潜力巨大。我国临床研究工作者，谷涌泉，黄平平，杨晓凤等教授，利用骨髓间充 质干细胞，外周血间充质干细胞，脐带血间充质干细胞治疗下肢缺血，取得了良好的疗效 。2011年底，由中华医学会医学工程学会干细胞工程专业委员会组织编写的自体干细胞 移植治疗下肢缺血的专家共识公布，这是国内首个指导临床干细胞移植治疗的规范化方 案。全文如下。2013年11月13日上海召开的干细胞技术论坛，黄平平教授，谷涌泉教授将 针对干细胞质量下肢缺血性疾病做精彩报告。“ i0 D2 Z/ W0 0 Z 3 e7 A; , y w1 T 下肢缺血是一种常见疾病，具有发病率高，致残率高和治愈率低的特点。在我国造成下肢 缺血的主要病因是动脉粥样硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎、糖尿病足等。临床表现主要 为早期的间歇性跛行，中期的静息痛和晚期的组织缺损，后者包括溃疡和坏疽。一般来讲 ，通过下肢动脉旁路移植或下肢动脉介入治疗可以达到增加行走的距离，缓解疼痛，或者 促进溃疡的愈合等的目的。然而，对于部分患者，由于下肢远端动脉流出道不良，动脉旁 路移植和介入治疗无法完成，或者效果不良，就面临着截肢的危险，甚至危及生命。尤其 是糖尿病下肢缺血和血栓闭塞性脉管炎患者，病变多累及下肢远端小动脉，在过去这部分 病人就难以避免截肢。而自体干细胞移植作为血管再生的新技术，正好为他们提供了一种 新的救肢方法。 干细胞移植治疗下肢缺血的主要目标是促进下肢血管新生。而其中起主要作用是造血干细 胞。正常情况造血干细胞主要存在于骨髓中，外周血液循环中很少。而通过骨髓动员刺激 后造血干细胞可以被动员到外周血液循环中，因此目前临床上常用的三种不同来源的自体 干细胞方式治疗下肢缺血，即单纯骨髓来源的自体干细胞移植、外周血来源的干细胞移植 和骨髓动员后的骨髓来源的干细胞移植。 自体干细胞移植至少有以下几个优点：1、不存在异体干细胞的免疫排斥；2、没有胚胎干 细胞的伦理道德问题；3、作为患者本人的细胞，仅仅是采用富集提纯的办法，没有在体外 进行诱导分化和增殖，也不存在基因突变的风险；4、在严格无菌下操作，体外分离时间短 （2个小时左右），微生物污染的可能性小；5、正如患者本身的植皮一样，都是患者本身 的组织，具有取材方便的特点。因此，目前自体干细胞移植治疗疾病呈现出广阔的前景。 x. r f: M( b1 t! Z# |“ ) C% D 根据干细胞的来源不同，自体干细胞移植一般分为骨髓的干细胞和外周血的干细胞移植和 改良的骨髓干细胞移植。- _$ ) X. X( ; x2 C : g; / f“ h“ A% y8 E2 “ C 1自体骨髓干细胞移植8 E) i G. C. A. s$ V8 |0 P / A. K3 b“ N P( s 目前研究认为,骨髓单个核细胞中的34阳性细胞是EPC的主要来源，CD34(CD34为造血 干细胞及内皮细胞表面标记物)细胞,在末梢血中只有骨髓的0.2%。可测定的最幼稚细胞在 1末梢血中仅有2.9个,为骨髓的1%。这就提示,骨髓细胞有可能提供更多的EPC用于血 管新生疗法。骨髓单个核细胞(BM- MNC)移植是由EPC移植衍生出来的一种血管新生疗法。成年个体的BM- MNC中含有多种干细胞成分,其中EPC含量约占BM- MNC总数的3%,为外周血的15倍,同时BM-MNC移植还可以提供多种促血管生长因子,故BM- MNC移植兼具EPC和细胞生长因子的作用。故应用自体骨髓细胞移植的优点可归纳为1) 包括EPC,能够参与缺血病变中的血管形成;(2)能产生诱发血管生成的一些生长因子和细胞 因子;(3)不会发生异体骨髓移植的移植物宿主疾病；（4）分离EPC 花费高昂,耗时费力,且分离EPC的同时也去除了可能促进血管生成的细胞和细胞因子。故目 前治疗下肢缺血时多采用含有EPC的单个核细胞进行移植。Shintani等（1）将兔的自体骨 髓单个核细胞注入缺血下肢的腓肠肌,2周后发现移植的骨髓单个核细胞存在于骨骼肌的新 生内皮细胞毛细血管网,毛细血管密度较对照组增加, 提示自体骨髓单个核细胞局部移植增加缺血下肢的新生血管形成和侧支血管形，取得了较 好的临床疗效。 $ e- F) F4 k# K4 M: d2 j! Z, u“ M Tateishi等（2）首次报道应用自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病, 开创了血管新生在临床应用的先例; 谷涌泉等（3）首先在国内应用自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血性疾病并取得了成功。目 前已经治疗了500余例患者，取得了令人兴奋的疗效（4- 6）。谷涌泉等不仅采用了国外的方法，即下肢肌肉局部注射；而且还在国际上率先采用了 经下肢动脉导管注射的新方法（6），并对这2种不同自体骨髓干细胞移植的方法治疗严重 下肢缺血性疾病进行了对比，发现这2种方法的疗效在统计学上没有明显差异。 7 T% S8 j5 Z2 T* p6 p1 L 2自体外周血干细胞移植 6 K5 k+ I“ R2 D w“ x! u 正常生理状况下,“定居”骨髓的绝大多数骨髓干细胞(99.15 %) 处于休眠状态(G0 期) , 仅0.65 %的骨髓干细胞在血液中“游行”和“巡逻”。当某些组织中的细胞因衰老等原因死亡时, 此部位会产生一“位置缺陷”信号, 此信号的产生不仅来自细胞死亡后留下的位置空缺信号且细胞破裂后释放的胞内细胞因子 及蛋白分子, 也可产生此部位局部浓度梯度的改变。这些因变化而产生的信号将使骨髓干细胞被“征募” 到循环中参与远处多种组织的再生。但这种“自发”的“征募”作用较弱, 人们想到用骨髓干细胞动员剂将骨髓干细胞“驱赶”到外周血中, 从而使外周血干细胞达到治疗数量, 利用干细胞“自发”的向损伤组织“归巢”, 并在特定的组织微环境作用下分化为受损组织细胞的特性, 达到修复缺血损伤的作用。利用骨髓和外周血干细胞池之间的动态平衡,动员骨髓干细胞促 进其进入外周血以供采集、移植，从而使自体外周血干细胞移植成为一种治疗缺血性疾病 有效的途径之一。 h% g% o) 0 U8 F0 v 中国医学科学院天津血液病研究所黄平平等（7）在采用外周血干细胞治疗白血病的基础上 ，采用类似的技术手段，在国际上最早开展了自体外周血干细胞移植治疗下肢缺血并取得 了成功。他们研究的临床效果很令人鼓舞。谷涌泉等（8）和沈阳空军第463医院（9）也 相继开展此技术。 W! n. x9 m! x/ j( . K 自体外周血单个核细胞移植治疗下肢缺血性疾病也是一种简单、安全、有效的方法；然而 由于骨髓动员期间，外周血液循环中单个核细胞的量增加明显，外周血的粘稠度明显增加 ，血管内血栓形成的机会大大增加，从而增加心肌梗死或/脑梗塞发生的危险。因此，在骨 髓动员早期就应采用正规的抗凝措施，在整个过程中需要注意心脑血管并发症的发生。 “ e! r2 f4 * |7 , G8 J 3改良的骨髓干细胞移植 3 8 J R! L y( 在单纯骨髓干细胞移植中，骨髓血的抽取量一般在400500ml，得到的骨髓单个核细胞总 数在13 x109个。由于病人大多年龄比较大，体弱并多伴有其它疾病，如冠状动脉硬化性心脏病或/ 和脑动脉硬化症等，如果一次抽取过多的骨髓血，势必造成其它并发症。一种新的方法， 就是骨髓动员刺激以后的骨髓干细胞移植，称之为“改良的骨髓干细胞移植”（10）。主要 步骤是在抽取骨髓前使用粒细胞集落刺激因子（GSF）刺激骨髓2- 3天，每天300ug；然后抽取骨髓血110- 200ml，在干细胞实验室分离纯化后再进行移植。从临床研究的资料中发现：无论是主观 评价指标，或是客观评价指标均比单纯的骨髓干细胞移植和外周血干细胞移植的疗效明显 提高；而且不良反应也较外周血干细胞为少。与前2种方式相比较，此方式的主要优点是： （1）抽取骨髓血量少于200ml，对患者全身影响不大；（2）动员时间不长，外周血液中 单个核细胞的数量不高，血液粘稠度比外周血干细胞低，发生心脑血管意外的几率较小。4 R1 z5 j7 z: U+ J% , Y / X( w# v * Q- H) D- m, i 临床应用 P! n; R8 m! O, E 一、技术的准入( T2 t2 |4 U5 |# ) p8 p 德问题，但是专家们认为：一般需要医院的医学伦理委员会和新技术委员会的批准。% l6 9 V) W2 R 二、病人的选择（适应症与禁忌症）“ I+ n. A; | J5 T/ （二）禁忌症：“ J6 G. c# t1 R$ U# G T! 5 1、控制不好的糖尿病病人；2、过去5年内明确有恶性疾病的患者或血中肿瘤标记物（AFP ,CEA,PSA,CA19- 9,CA125）水平明显升高者；3、严重心、肝、肾、肺功能衰竭或一般状况很差不能耐受干 细胞移植手术者；4、近期有心肌梗死或脑梗塞病史者禁忌，而有冠心病、脑缺血病史者也 要慎用；5、目前仍在吸烟又不准备戒烟者；6、主动脉、髂动脉等大动脉闭塞者。 ?1 “ b1 9 y$ c5 G1 x 在移植部位要备皮等处理，需要血管腔内介入方法的患者，术前可以先行碘过敏试验，合 理抗生素选用，并行过敏试验等。 ( w* # / 5 n0 / H S+ D 1、手术当天要禁食水，静脉输液保证患者的基本的需求量和营养。如果术前血色素低 E% b$ k4 T) R: y+ h! x) h( s2 w 于10g，建议备血200ml，在穿刺骨髓，抽取骨髓血之前缓慢输血。 五、实验室的处理（干细胞制备）-详见附节2。0 E6 y+ * Q G$ f |) y7 M) x3 ( $ l* o D% r: s: v 六、干细胞移植的方法、步骤和措施 % _8 W0 R, ; v, S$ E- D+ a“ g 一般由2种方法可以移植，分别为：缺血肢体的局部注射移植和下肢动脉腔内注射移8 B I( K/ s% b( N% W! c( G % |3 * 4 h% l. x: V D6 K: D 植。医生可根据患者的身体情况和病变情况选择适合患者的方法进行移植。 （一）局部缺血肌肉注射： : F H! I ?1 ) 6 _ 1、麻醉可选用硬膜外或者腰麻，也可选择静脉复合麻醉。由于注射范围广，次数多，局部 麻醉不推荐。麻醉成功后，可以消毒、铺巾。也可以先消毒、铺巾后再麻醉。 * 3 n Z p“ R“ l 2、抽取20-50ml的生理盐水稀释制备好的干细胞悬浊液，然后抽取上述稀释后的干细 - l% # i, p4 t“ V# o3 胞悬浊液备用。; “ n“ N6 j0 N/ I- s- d 3、在注射部位划出要注射的具体位置。一般针距2ml左右。每针注射1ml。 % |5 M5 w; | - Q k. 2、注射后用酒精纱布消毒皮肤后包扎。8 j7 |* - # m0 8 Q2 c! N; w 八、干细胞移植术后评价 （一）安全性评价$ X4 e( K/ O/ V, 9 e) l: K$ 干细胞移植的安全性问题不容回避。对干细胞移植安全性的忧虑主要是免疫排斥和肿瘤生 长的问题。采用自体干细胞移植将不存在免疫排斥的问题；但由于干细胞是未分化细胞， 移植的干细胞是否会在移植部位分化为其他组织如骨组织或出现肿瘤样生长？我们的病人 中有一些患者移植后未能避免截肢，对30余例截肢标本的病理学检查，并未发现移植部位 有成骨现象和肿瘤征象；500多例未观察到严重不良反应。而且我们的病例中有相当一部 分随访时间超过了5年（11），可以说明本技术方法是安全的。因此，对于安全性的评价 ，必须注意下面几点：1 a7 o3 W9 f. A2 N . i* 2 K6 , N5 L8 J. z8 u% M 1、是否有致瘤性？2、有无局部的不良反应？包括局部有无红、肿、热、痛等炎症反应及 过敏反应？3、有无全身的不良反应？4、术后肝肾等功能的变化？ 6 z/ b: v* X; n+ s （二）有效性评价 临床观察有效性的主要指标和方法主要包括主观指标和客观指标。其中主观标包括以下几 点：疼痛、冷感、麻木等主观症状的改善程度。而尽管是主观指标，也要尽量地客观化。 我们采用一个分数标准来评价这些主管指标。 : L* E# C, w6 B3 P 1、疼痛：疼痛评分标准：0分：无疼痛；1分：偶有疼痛，被问及能回忆起；2分：疼痛经 常出现但能耐受，不需或偶用一般止痛剂；3分：经常用一般止痛剂；4分：因疼痛影响睡 眠，一般止痛药剂难以缓解。 治疗前：（ ）分；治疗后：（ ）分。 _; w# F6 9 w3 w 累肢体经常有发凉、怕冷的感觉；3分：受累肢体有明显的冷、凉感觉，需要采用局部保温 措施，症状能得到一定程度的缓解；4分：受累肢体有明显的冷、凉感觉，采用局部保温措 施，症状也无明显改善。治疗前：（ )分；治疗后：（ ）分。 ! Y# m# x7 8 Y+ B+ 3、麻木的评分标准：0分：无麻木；1分：偶感轻度麻木；2分：经常有轻度麻木不适 - z$ x$ O( e“ d+ x 3分：麻木感觉明显，但可以忍受；4分：麻木非常明显，难以忍受，严重影响日常生活。 治疗前：（ )分；治疗后：（ ）分。# X/ E2 K A8 q1 V$ X, Y1 f1 L8 O * e/ t* : J8 n x 尽管干细胞移植是一种比较安全的方法，我们仍要特别重视干细胞移植后不良反应的处理 ，以免造成一些不必要的损失和麻烦。 目前根据我们的经验，不良反应主要由以下几个方面1、局部不良反应：主要表现局部红、 肿、热、痛等炎症反应。对于此类反应可以采用酒精纱布外敷，抬高患者肢体等措施，并 试用抗生素等。（2）全身不良反应：主要有疲劳，全身乏力等，可以使患者卧床休息、静 脉输液加速体内一些毒素的排泄。 E c: _! N. f4 d7 _1 K( O 二、干细胞移植临床应用的启示-如何改进技术，提高疗效和安全性 3 0 $ t# P, 8 t# g3 m 目前干细胞移植的疗效还没有达到十分完美的程度，如何改进技术和提高疗效是我们今后 需要进一步研究的工作。我们目前采用改良的骨髓干细胞移植使疗效能够提高5- 10%，这也是我们今后更要加强研究的措施之一。此外我们认为：提高干细胞的必须注意 以下几点： ) s. v; p+ $ b 1、严格适应症的选择：如果适应症的选择不合适，就不可能有比较好的疗效。2、尽量采 用骨髓动员的方式；骨髓动员后取骨髓干细胞优点：（1）动员时间短，外周血白细胞数不 致太高，（2）采髓量降低，并发症少，（3）干细胞数量增加，疗效提高。3、尽量选择 膝下病变者：（1）膝下病变效果明显高于大腿动脉闭塞者，（2）大腿动脉- 股浅动脉病变的疗效优于股总动脉病变者。4、实验室条件与管理- 干细胞的制备：（1）注意无菌观念，（2）每一步都要严格操作,尽量减少干细胞在制备过 程中的丢失，（3）与血液科的白血病干细胞制备有一定区别，尽量选用大试管离心，也是 达到减少干细胞的丢失。5、注射部位要掌握好。 : d“ A% o% P8 c 总而言之，干细胞移植在治疗下肢缺血疾病既安全又有效，是一种具有非常广阔的前景 方法，而且操作简单，费用低廉，值得我们推广。 - t“ h$ X- o, +