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乳腺癌基因治疗研究进展 The research progress of human breast cancer gene therapy 曾 赵 军 中南大学生物科学与技术学院 分子生物学系 2 乳腺癌是严重危害妇女健康的恶性 肿瘤。据国际抗癌协会（IARC） 公布的统计资料表明，乳腺癌在全 世界大多数地区的发病率有逐年增 高的趋势，现已成为女性发病率最 高的恶性肿瘤。 第一节 乳腺癌基因治疗研究背景 3 乳腺癌的危险因素： (1)与发育、激素水平有关 (2)与营养膳食有关 (3)与家族史和基因改变遗传因素有关 a. 抑癌基因失活 b. 癌基因异常 (4) 其它危险因素 4 乳腺癌肿瘤治疗模式 手术、放疗、化疗、激素治疗是肿瘤治疗的 常规模式。这些治疗方法常难彻底消灭肿瘤 细胞又易伤及正常组织，特别是伤害机体的 免疫系统。目前肿瘤的基因治疗日益受到人 们的重视，显示出良好的应用前景。 5 乳腺癌发病的分子机理主要有两个方面： 第一、基因表达异常。 最常见的基因表达异常是cyclin D1、neu和 ras、c-myc 或 Wnt-1 原癌基因过表达。 第二、基因结构改变。 包括染色体缺失与基因扩增。 第二节 乳腺癌自杀基因治疗的 概念、内容与特点 6 Breast cancer gene therapy using tumour suppressor genes Clinical trials of p53 gene replacement have had limited success ; PTEN expression alters metastatic potential and reduces neovascularization 7 Prospects The ability to induce growth arrest and apoptosis Downstream targets of p53 and Rb is necessary Clinical trials of second-generation oncolytic viruses Combinations of tumour suppressor genes 8 乳腺癌抗体治疗疗 单克隆抗体 Herceptin(贺赛汀) 针对HER-2/neu原癌 基因的人/鼠嵌合单 抗，与细胞表面的 erb-B2受体结合,抑 制乳腺癌细胞的生长 ,产生抗体依赖细胞 介导的细胞毒作用。 免疫基因治疗 指在基因水平，通过诱发或加强机体内针对肿 瘤细胞表面的肿瘤相关抗原（TAAs）的特异性 免疫反应，调动宿主的免疫系统来识别并破坏 癌细胞。 乳腺癌组织表达多种TAAs，包括HER-2/neu （c-er -2）、MACG-1和MUC-1等，机体针对这 些TAAs产生一定的特异性体液和细胞免疫反应 。 将编码促进免疫反应的细胞因子的基因直 接在体内转染到肿瘤细胞内，或在体外 将这些基因转染到肿瘤细胞内，在肿瘤 细胞经放射线照射灭活后，自身移植于 体内，以增强免疫反应。包括IL-2、IL- 12、干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激 因子（GM-CSF）等。 10 采用特异的靶抗原作为疫苗对肿瘤的免疫反应更有效。 目前用于乳腺癌免疫治疗的特异抗原包括HER-2、CEA、 MAGE-1、MUC-1等。 采用基因工程将编码这些抗原的基因修饰后，克隆到逆 病毒载体，转入体内；或在体外采用基因工程，将这些抗 原的不同抗原簇克隆，产生不同抗体，筛选出能抑制肿瘤 细胞生长的抗体。 赫赛汀（Herceptin）就是针对c-er-2细胞外区域不同抗 原簇的人单克隆抗体。它可有效抑制c-er-2的下游信号传 导，从而抑制乳腺癌细胞的生长。 特异性靶抗原的免疫治疗 肿瘤抑癌基因治疗 野生型p53基因具有通过调控视网膜母细胞瘤基因控 制细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用。但是，由于乳腺 癌细胞中p53易突变而失活，影响了p53基因治疗乳腺 癌应用。在乳腺癌家族中发现抑癌基因BRCA1常存在 突变而表达过低。 在乳腺癌动物模型中采用装有BRCA1的逆病毒载体 ，直接注射入瘤内，可抑制晚期乳腺癌胸壁转移瘤的 生长。 化学基因治疗 将耐药基因，如多药耐药基因（MDR）转入造血干细胞 ，然后自体回输以增加化疗药物剂量，增强疗效，也不影 响机体的造血系统。 Cowan等将4例乳腺癌病人的造血细胞提取后，体外转 染MDR基因，并且在体外应用大剂量化学药物杀死可能污 染的肿瘤细胞后，将转染了MDR的造血细胞自身移植。给 予大剂量的化学药物治疗后，3例病人移植细胞中仍可检 测到MDR的表达，转染MDR的细胞存活率与骨髓抑制成反 比，无严重毒副作用发生。 药物前体激活基因治疗（GPAT）可以利用正常和肿瘤 细胞之间的某一基因转录差异，选择性驱动表达导入肿 瘤细胞内的无活性化疗药物前体转化为有活性的代谢产 物，特异性杀伤肿瘤细胞。 氟脲类药物对乳腺癌有杀伤作用，但5-氟胞嘧啶核苷酸 （5-FC）作为药物前体，对细胞无杀伤作用，而它在嘧 啶脱氨酶的转化下，可代谢为有活性的5-FU（5-氟尿嘧 啶）而具有杀伤肿瘤细胞的能力。 化合物中筛选出一种名为维生素B17的化合 物。维生素B17可以通过竞争性结合ATP， 不可逆地抑制c-er -2活性，而不影响其蛋白 表达。动物实验表明，维生素B17可使c-er - 2过度表达的乳腺癌肿瘤缩小。 显性基因敲除治疗 敲除显性的癌基因，削弱肿瘤的生长和浸润 能力。研究表明，一种myc反义核酸对雌激 素依赖型和非依赖型乳腺癌细胞均有抑制作 用，转化生长因子（TNF-）的反义信使 RNA能够抑制雌激素诱导的雌激素反应性乳 腺癌细胞的增殖。 抗血管生成基因治疗 抗血管生成基因的因子包括内皮抑素、血管抑素 和干扰素-。基于肿瘤和正常内皮细胞之间基因 表达的差异，选择性抑制肿瘤内皮细胞中异常基 因的表达，抑制肿瘤血管生成，从而达到治疗肿 瘤的目的。 最强的血管生成细胞因子是VEGF。反义核酸， 可溶性VEGFR、核糖酶、抗VECF单克隆抗体和 受体酪氨酸激酶（RTK）抑制剂已被用于抗肿瘤 血管生成的基因治疗。 18 自杀基因治疗乳腺癌的作用机理 病毒载体 病毒蛋白 自杀基因药物前体 毒性代谢物 乳腺癌细胞 直接杀伤癌细胞 通过旁观者效 应杀伤癌细胞 19 自杀基因 HSVtk 编码胸腺嘧啶激酶，在 细胞内，自杀基因HSVtk 能将核苷类似 物 GCV 磷酸化，使其进一步代谢为三磷 酸 GCV，抑制细胞 DNA 聚合酶，影响 DNA合成，导致细胞死亡，达到清除肿 瘤的目的。 20 存在的问题 ？ 目的基因的表达不受控制，存在过度 表达或不适当表达，特别是当插入基 因是一些毒性的基因或对机体有影响 时，不仅对疾病的治疗不利，甚至会 导致致命的副作用。 21 特异性的转录调控元件使治疗基因准 确、有效地表达于肿瘤细胞，使治疗 基因的表达受体外因素的调控，提高 基因治疗的有效性和可控性，是基因 治疗领域的一个重要问题。 第三节 乳腺癌自杀基因调控治疗 22 乳腺癌基因治疗的调控元件 1)乳腺癌相关基因：erbB-2、Muc-1、 p53、BRCA1、BRCA2、nm23、p16等； 2)组织特异性基因:雌激素反应元件 (ERE)、人乳白蛋白基因(hALA)、羊乳 球蛋白基因(oBLG)等； 3)缺氧反应元件(HRE)等。 23 Tet 基因表达调控系统 Tet 系统利用大肠杆菌抗 四环素操纵子 的阻遏与去 阻遏作用来调控基因表达 ，使基因表达受四环素的 精确调控。Tet 激活系统 （Tet-On）是突变的 tet 阻遏蛋白与 VP16 的激活 域融合表达 rtTA , 强力霉 素存在时，rtTA 与 tetOp 结合，激活靶向转 录 。 24 Tet-On 调节乳腺癌细胞株 HSVtk 表达及 体外调控性治疗作用的实验研究 25 重组逆转录病毒载体 pRevTRE/tk的构建 PCR 扩增获得 HSVtk 基因 DNA 片段，设 计引物时，在 引物 TK1 的 5 加上BamH酶 切位点，引物 TK2 的 5 加上 Hind 酶切位 点，定向克隆 到pRevTRE质 粒上, 得到 pRevTRE/tk质 粒。 26 重组逆转录病毒载体 pRevTRE/tk的鉴定 M 1 2 图 1 重组质粒 pRevTRE/tk的 酶切鉴定结果 M: DNA/ Hind DNA Marker lane 1: pRevTRE/HSVtk / Bam HI + Hind ; lane 2: pRevTRE/HSVtk plasmid DNA 图 2 重组质粒pRevTRE/tk 的PCR鉴定结果 M: 100bp DNA ladder Marker; lane 1: PCR product with primer TK1 and TK2; lane 2: PCR product with primer TK3 and TK4 27 MCF-7细胞转染实验 MCF/TRE/MCF/TRE/tktk/ /TetTet-On-On 28 Tet-On 基因调控系统中，其发挥作用所需 的两个组成元件：TRE 元件和rtTA 元件， 分别克隆于两个载体系统中。使用时先将 含有TRE元件和目的基因转染入宿主细胞， 然后再以含有 rtTA 的质粒转染该细胞， 经过两次转染而构建出细胞株。 29 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞 HSVtk 基因的表达 图 3 Dox 调节 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞中 HSVtk 基因的表达 M : 100 bp DNA Marker; Lane 1-6代表 Dox 浓度为0，0.1，1，10，100, 1000 g/ml时细胞 HSVtk 基因的表达 30 MTT 法检测分析 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞存活率 图 4 在 Dox 浓度为 1g/ml 时，MTT 法检测 GCV不 同浓度时 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞存活率的变化 31 Dox 浓度对 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞生长的影响 图 5 GCV 浓度为 1 g/ml 时，不同浓度 Dox 对 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞存活数的影响 32 旁观者效应 表 1 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞旁观者效应的克隆记数 1组组 (n=4) 2组组 (n=4) 3组组 (n=4) 4组组 (n=4) 5组组 (n=4) 6组组 (n=4) MCF-7 100%95%90%75%50%0% MCF/TRE/tk/Tet- On 0%5%10%25%50%100% 克隆计计数(均值值 SE) 36.00. 81 34.00. 81 4.50.655.00.7 1 5.00.583.50.5 0 33 可调控性自杀基因乳腺癌动物模型的建立 以表达 HSVtk基因及调控系统 Tet-On 的 乳腺癌细胞 MCF/TRE/tk/Tet-On 直接接种 SCID 小鼠成功建立了可调控性自杀基因乳 腺癌动物模型，为探讨自杀基因体外调控 机制的研究奠定了基础。 34 SCID小鼠体内成瘤及治疗前后肿瘤大小的变化 图 6 乳腺癌细胞 MCF/TRE/tk/Tet-On 接种 SCID小鼠后， NS组、GCV组、GCV+Dox组 SCID小鼠肿瘤体积的变化 35 SCID小鼠肿瘤组织病理学观察 图 7 三组 （NS组、GCV组、GCV+Dox组）SCID 乳腺癌小鼠 经治疗15天后肿瘤组织病理学观察 H-E染色（250） A. NS 对照组; B. GCV 治疗组; C. Dox+GCV 治疗组 36 RT-PCR 检测 SCID小鼠肿瘤组织 HSVtk的表达 M 1 2 3 图 8 RT-PCR 检测各组 SCID小鼠肿瘤治疗15天后 HSVtk的表达 M: 100bp Marker; 1. GCV治疗组; 2. Dox+GCV治疗组; 3. NS 对照组 37 研究背景 逆转录病毒载体用于 ex vivo基因治疗，实际感染效率低 。 原因: 一、感染正在分裂的细胞； 二、获得病毒滴度低； 三、病毒半衰期短，移动距离有限, 在一个半 衰期内大多数病毒不能到达靶细胞。 重组逆转录病毒介导的 HSVtk基因 表达及提高逆病毒滴度的初步研究 38 逆转录病毒的纯化 将初步浓缩的病毒液经冷冻干燥 去除更多的水分，以小体积的缓 冲液（DMEM）复溶后70冻存得 到浓缩病毒液。 39 产毒 PA317 阳性细胞克隆筛选培养 图 14 微乒乓感染 pRevTRE/ HSVtk、 pRevTet-On 、 pRevTRE 载体的 PA317 细胞经潮霉素B、G418 筛选2周 后形成的抗性克隆 (100) 40 不同培养时间与重组病毒滴度的关系 图图 9 9 不同培养时间对克隆 PA317 细胞产生重组 病毒滴度的测定 41 不同丁酸钠浓度和重组病毒滴度的关系 0 5 10 15 20 图图 1010 不同丁酸钠浓度下对克隆 PA317 细胞培养 30h 产生重组病毒滴度的测定 42 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测有无病毒蛋白表达 图图 1111 克隆 PA317 细胞上清 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 M： 蛋白质分子标准； Lane 1： pRevTRE DNA转染 PA317 30 h 后细胞上清； Lane 2： pRevTRE/tk DNA转染 PA317 30 h 后细胞上清 43 PCR 检测克隆的细胞上清有无 HSVtk 基因插入片段 1, 240 bp 图图 12 12 转染转染 PA317PA317细胞上清细胞上清 PCR PCR 扩增扩增 HSVtk HSVtk 基因基因 MM： 100100 bp bp DNA DNA 标准物；标准物； Lane 1Lane 1：pRevTRE/tk DNA转染 PA317 30 h 后细胞上清； Lane 2Lane 2：pRevTRE DNA转染 PA317 30 h 后细胞上清 44 RT-PCR 检测被逆转录病毒浓缩液感染的 MCF-7 细胞中 HSVtk 基因的表达 -actin 420 bp 图 13 逆转录病毒浓缩液感染的 MCF-7细胞中 HSVtk 基因的表达 M： 100 bp DNA 标准物； Lane 1： MCF-7 细胞 ； Lane 2： 被重组逆转录病毒液感染的 MCF-7 细胞 45 产毒性细胞系分泌重组病毒的 PCR鉴定 图 15 pRevTRE /tk 、 pRevTet-On、 pRevTRE 乒乓转染的 PA317 细胞上清 PCR 扩增目的基因 M： 100 bp ladder marker； 1： 转染 pRevTRE/HSVtk 质粒载体的克 隆 PA317 细胞上清； 2： 转染 pRevTet-On 质粒载体的克隆 PA317 细胞上清； 3： 转染 pRevTRE质粒载体的克 PA317 细胞上清 46 重组病毒感染 MCF-7 细胞及阳性克隆 细胞株的筛选 图 16 重组病毒感染 MCF-7 细胞后筛选的潮霉素B 和 G418 抗性克隆 (100) 可调控性重组逆转录病毒在乳腺癌基因治疗中 的实验研究 47 制备重组逆转录病毒 RevTRE/HSVtk 和 RevTet-On，然后通过逆转录病毒感染靶细 胞，将 Tet-On 基因调控系统中的反应元 件 TRE 和 rtTA 调控元件共同整合到同一 宿主细胞中，使目的基因导入靶细胞，并 处于 Tet-On 基因的有效调控，同时也提 高了外源目的基因的转导效率。 48 病毒感染细胞基因组 DNA 的提取与酶切 图 17 病毒感染细胞基因组 DNA 的提取与酶切图 M：Lambda DNA/EcoRI+ Hind DNA Marker； 1： 逆病毒 RevTRE/HSVtk 和 RevTet-On 感染 MCF-7 细胞基因组 DNA； 2： MCF-7 细胞基因组 DNA； 3： MCF-7 细胞基因组 DNA EcoRI酶切； 4： 逆病毒 RevTRE/HSVtk、RevTet-On 感染 MCF-7 细胞基因组 DNA EcoRI酶切 49 逆病毒感染细胞 Southern印迹杂交分析 M 1 2 3 图 18 细胞 Southern 印迹杂交分析图 M： 100 bp ladder marker； 1： MCF-7 细胞； 2： 逆病毒 RevTRE/HSVtk、RevTet-On 一次感染的 MCF-7 细胞； 3： 逆病毒 RevTRE/HSVtk、RevTet-On 重复感染的 MCF-7细胞 50 利用微乒乓感染的方法将制备的重组逆转录病 毒 RevTRE/HSVtk 和 RevTet-On 导入乳腺癌 细胞株 MCF-7 细胞。实验中观察到，HSVtk 基因的表达受 Dox 的诱导调控，随着 Dox 的 浓度增高，GCV 对乳腺癌细胞的杀伤能力加强 。 51 台盼蓝排斥试验和细胞计数分析检测细胞活力 图 19 不同 Dox 浓度诱导下台盼蓝排斥试验和细胞计数 52 MTT 法检测重组病毒感染的 MCF-7 细胞不同药 物浓度诱导 24 h 的存活率 n=4n=4n=4n=4 53 流式细胞分析 图 20 流式细胞仪 （FCM）检测细胞凋亡图 1： MCF-7 细胞； 2： 逆病毒 RevTRE/HSVtk、RevTet-On 感染的 MCF-7 细胞； 3： 1g/ml Dox、2g/ml GCV 作用 48 h 的逆转录病毒感染 MCF-7 细胞 54 流式细胞仪 （FCM）检测细胞周期 图 21 流式细胞仪 （FCM）检测细胞周期图 1： MCF-7 细胞； 2： 逆病毒RevTRE/