生物样品前处理方法ppt课件

生物样品前处理方法 contentcontent 生物样品处理目的 前处理过程及方法 分析方法的限度要求 生物样品的种类 置含有抗凝剂的试管中， 25003000rpm离心5 10min，淡黄色上清液， 约为全血的50-60% 药物动力学，生物利用度 ，临床治疗药物浓度监测 置试管中，于37或室温 放置30min1h，血液 凝固后，剥去试管壁上的 血饼，25003000rpm离 心510min，淡黄色液体 ，约为全血20-40% 血清的获取量小，但血 清成分更接近于组织液的 化学成分，测定血清中有 关物质的含量，比全血更 能反映机体的具体情况 加入抗凝剂混合，防止凝 血后影响测定 对于与红细胞结合的药物 ，以及血浆浓度低或药物 在血浆与红细胞分配比不 恒定的情况下应用 一. 生物样品的种类 一般采集时间尿（规定时间内 采集尿液体积和排入尿中的药 物总量）药物浓度高，但变化 体内药物清除 以原形、I相及 II相代谢物等多种形式通过尿液 排出排出 预测药物代谢过程、类型,计 算药物尿清除率、生物利用度 的研究。 在漱口后15min，安静状态下采 集口腔内自然流出的唾液；也可 在刺激下快速采样，石蜡片，聚 四氟乙烯块，纱布球，柠檬酸， 维生素C等置于舌尖，弃取初始部 分后采集 血浆游离药物浓度（P）密切 相关，可使用唾液样品CS/CP比 值较恒定时，可代替血样进行 TDM及药代动力学研究 头发 组织：脑、心、肝、脾、肺、肾、胃等 目的目的 去除生物样品中的大分子杂质， 满足测定方法对分析样品的要求 保护仪器性能，改善分析条件 分离并富集所要测定的成分 药物从缀合物及结合物中释放 测定药物的总浓度 二.生物样品处理的目的 蛋白质 蛋白质 蛋白质 蛋白质 内源 性酸 内源 性酸 内源 性酸 药 药 药 药 药 加入强 酸 超滤 法 加入中 性盐 加热 法 酶水解 法 溶剂解 法 加入 重金 属盐 三.前处理过程及方法 1.1-溶剂解法 原理：使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变 化而使蛋白质凝聚 。 常用有机溶剂：乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃 试剂用量：溶剂体积与血样比为13 1 操作：有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后 离心分离，取上清液作为样品。注意采用 超速离心 （12000rpm）分离12min 1.2 加入中性盐 原理：中性盐使蛋白质脱水而沉淀 常用中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸 盐 及枸橼酸盐等 试剂用量：饱和硫酸铵与血清比例为21 操作：血清与中性盐按一定比例混合后超速离心 （10000rpm）分离12min，取上清液作为样品。 上清液pH 7.07.7。 1.3 加入强酸 原理：强酸与蛋白质形成不溶性盐而沉淀。 常用：10三氯醋酸、6高氯酸、5偏磷酸等。 操作：血清与强酸的比例为1：0.6混合，离心（10000rpm ）12min，即可。 上清液 pH 04，不适于酸性下分解 的药物。 过量酸的排除：过量三氯醋酸可通过煮沸或乙醚提取除 去；高氯酸、偏磷酸等可用碳酸钾、醋酸钾或氢氧化钠 等中和后加乙醇使产生高氯酸钾（钠）沉淀被除去。 1.4 酶水解法 测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物 枯草菌溶素：使组织溶解，使药物析出。 一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在较宽的pH活圈 （PH7.011.0）内使蛋白质的肽键降解，在5060具 有最大活力。 优点：可避兔某些药物在酸及高温下降解，对与蛋白质 结合牢的药物（如保泰松、苯妥英纳），可显著改善回 收率；可用有机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象。 不适用于在碱性下易水解的药物。 1.5 超滤法 性质：以多孔性半透膜（超滤膜）作为分 离介质的一种膜分离技术。 特点：无需加热；无需添加化学试剂；无 相变化；无破坏性；样品量少；简便快捷 ，结果稳定可靠 应用：游离药物首选方法，尤其适合TDM 操作：分子量截留值在5万左右的超滤膜 过滤可将分子量大的血浆蛋白以及结合了 药物的血浆蛋白分离。 尿中和有些血中的药物 葡萄 糖醛 酸 硫 酸 2、缀合物的水解 由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂 提取，所以： 酸水解可加入适量的盐酸液。 酶水解对于遇酸及受热不稳定的药物，常用 葡萄糖醛酸苷酶、硫酸酯酶或两者的混合酶 3.分离、纯化和浓集 3-1. 液-液萃取法 LLE 乳化现象：加固体NaCl；离心；低温冰箱中快速冻凝 对于极性大的药物：离子对提取法；提取烷基化法 有机溶剂 (1、2) 生物样品（水溶）(1) 药物 内源性杂质 溶解度、沸点低、无 毒、与水不溶：乙酸 乙酯、乙醚（1.2%水 ） 碱性药物于碱性； 酸性药物于酸性。 酸性； 水溶性 碱性； 亲脂性的 3-2. 固相萃取法 SPE 原理：不同填料作固定相的微型小柱，当含有药物的生物样 品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和 力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂 质后，再用适当溶剂洗脱药物。 亲脂型大孔吸附树脂，亲脂型键和硅胶 规格 亲水型硅胶，硅藻土，棉纤维 离子交换型 3-2. 固相萃取法 SPE 泵 甲 醇 1.柱预处理 2.进样 3.净化 4.洗脱 水 样 品 弱溶 剂 强溶 剂 固相提取步骤示意图： 被测组分的浓集 真空蒸发或抽真空挥发 直接通入气流使溶剂挥发 抽 真空 氮气或空气 分子中含有活泼氢者 （R-COOHR-COOH、R-OHR-OH、R-NH2R-NH2、R-NH-R)R-NH-R) 极性大 检测器不够灵敏 挥发性低 对热不稳定 增加药物稳定性 改变药物的极性和挥发性 ，改善被测组分的色谱行 为 提高对光学异构体分离的 能力 化学衍生化 4.化学衍生化 GC衍生化反应类型： 烷基化；酰化；硅烷化 活泼氢被烷基、酰基、硅烷基取代 光谱 GC、HPLC色 谱分析 HPLC-化学衍生化方法 柱前衍生法 柱后衍生法 荧光衍生化反应 电化学衍生化反应 非手性衍生化反应 HPLC-化学 衍生化 发生衍生化反应前后 反应特征 点击添加标题 紫外衍生化反应 先进的处理技术 1. 固相微萃取 SPME 基于待测物质在样 品和萃取涂层中的 平衡分配的过程。 相似相溶原理 材料： 聚二甲基硅氧烷 聚丙烯酸酯 SPME 与GC 及HPLC联用 2. 柱切换技术 是一种在线的固相分离技术 切换阀 3. 微透析技术 MD是一种膜分离技术，利用膜透析原 理，对细胞液进行流动性连续采样，在 不破坏生物体内环境的情况下，直